با استفاده از سه نوع ستون کروماتوگرافی گازی با قطر داخلی باریک
چکیده
تجزیه و تحلیل استرهای متیل اسید چرب (FAMEs) برای مشخصه‌سازی بخش چربی در مواد غذایی به کار می‌رود و یکی از مهم‌ترین کاربردها در تجزیه و تحلیل مواد غذایی است. این یادداشت کاربردی، جزئیات جداسازی مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME را بر روی سه ستون کروماتوگرافی گازی Agilent J&W CP-Sil 88 برای FAME، Agilent J&W DB-FastFAME و Agilent J&W DB-FATWAX Ultra Inert ارائه می‌کند.
با استفاده از ستون کروماتوگرافی گازی CP-Sil 88 برای FAME، تفکیک‌پذیری خوبی به دست آمد. ستون DB-FastFAME با بازده بالا، جداسازی عالی 37 FAME را تنها در 8 دقیقه ارائه کرد، در حالی که ستون DB-FATWAX Ultra Inert انتخاب‌پذیری منحصر به فردی را برای اکثر FAME های اشباع‌شده و غیراشباع چندگانه ارائه می‌دهد.
مقدمه
چربی ها نقش مهمی در مطالعات مربوط به تغذیه و شیمی غذا دارند. ترکیب اسید چرب چربی ها، مخلوطی پیچیده از ترکیبات اشباع، مونوغیر اشباع و چند غیراشباع با طول زنجیره کربنی متفاوت است. از آنجا که نقش اسیدهای چرب در بدن بسته به ساختار آنها متفاوت است، انجام تجزیه و تحلیل دقیق ترکیبی اسیدهای چرب موجود در مواد غذایی ضروری است.
تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی گازی (GC) اسیدهای چرب به عنوان مشتقات متیل استر آنها (FAME) یک ابزار مهم در مشخصه سازی چربی ها برای تعیین چربی کل و محتوای چربی ترانس در مواد غذایی است. [1، 2] انتخاب فازهای ساکن مختلف و سایر ابعاد ستون مانند طول ستون، قطر داخلی و ضخامت فیلم عمدتا به پیچیدگی ترکیب اسید چرب و نیاز به جزئیات جداسازی بستگی دارد.
به طور معمول، از ستون های مویینه با پلی اتیلن گلیکول (PEG) برای تجزیه و تحلیل FAME روغن ماهی های دریایی و نمونه های گوشت، از جمله تعیین اسید بوتیریک در چربی شیر استفاده می شود. این به این دلیل است که ستون های مویینه PEG، ایزومرهای FAME را بر اساس طول زنجیره کربنی و درجه غیر اشباع بودن جدا می کنند. با این حال، گزارش شده است که یکی از محدودیت های جدی ستون های PEG، عدم تفکیک بین سیس و ترانس است. همه ایزومرهای سیس و ترانس همزمان خارج می شوند. [3] بسیاری از روش های تأیید شده برای آزمایش مواد غذایی، در هنگام تعیین ترکیب اسید چرب توسط GC/FID، نیاز به جداسازی ایزومرهای خاص اسید چرب سیس و ترانس دارند.
برای تجزیه و تحلیل نمونه های پیچیده تر، مانند روغن های خوراکی، تفکیک پذیری بیشتر FAME ها با استفاده از یک ستون مویینه پوشیده شده با فاز ساکن سیانوپروپیل به دست می آید. ستون کروماتوگرافی گازی Agilent J&W DB-FastFAME با فاز میانی سیانوپروپیل، جداسازی سریع و عالی را برای مخلوط های پیچیده FAME ارائه می دهد و به برخی جداسازی های سیس/ترانس دست می یابد. برای جداسازی دقیق تر سیس و ترانس، ستون با سیانو-پلی سيلوکسان بسیار قطبی (CP-Sil 88 برای FAME/HP-88) ترجیح داده می شود. با این حال، برخی از طول های زنجیره کربنی معمولاً روی فازهای سیانو-پلی سيلوکسان همپوشانی دارند که باعث ایجاد مشکل در شناسایی پیک می شود. بنابراین، ستون های GC بلند (به عنوان مثال، 100 متر) و زمان های آنالیز طولانی برای دستیابی به جداسازی خوب FAME مورد نیاز است، با این حال، این منجر به بهره وری پایین می شود.
مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME
مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME برای تقلید از ترکیب اسید چرب بسیاری از نمونه های غذایی طراحی شده است و می تواند برای شناسایی کلیدی ترین استرهای اسید چرب (FAME) در بسیاری از غذاها مورد استفاده قرار گیرد. این مخلوط حاوی FAME هایی از C4:0 تا C24:1 است که شامل اکثر FAME های مهم اشباع شده، مونوغیر اشباع و چند غیراشباع (جدول 1) می شود.
این یادداشت کاربردی، آنالیز مخلوط 37 جزئی FAME را با استفاده از سه نوع ستون مویینه مخصوص تجزیه و تحلیل FAME، از جمله ستون های Agilent J&W CP-Sil 88 برای FAME، DB-FastFAME و Agilent J&W DB-FATWAX Ultra Inert GC، معرفی می کند.
مواد و روش ها
مواد شیمیایی و استانداردها
- مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME (شماره قطعه CDAA-252795-MIX-1 میلی لیتر) از شرکت ANPEL Scientific Instrument Co. Ltd (شانگهای، چین) خریداری شد. جدول 1 غلظت هر جزء در مخلوط را نشان می دهد.
- PUFA شماره 1 (منبع دریایی)، PUFA شماره 2 (منبع حیوانی) و PUFA شماره 3 (از روغن ماهی Menhaden) از شرکت Minn Bolin Bio-Tech Co. LTD (شنژن، چین) خریداری شد. این مخلوط به صورت 100 میلی گرم مخلوط خالص در دسترس است که به ترتیب 100 برابر با استون رقیق شد.
دستگاه
آنالیزها با استفاده از یک دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC) Agilent 7890B مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله (FID) انجام شد. معرفی نمونه با استفاده از یک نمونه گیر مایع اتوماتیک Agilent 7683B با سرنگ 5 میکرولیتری (شماره قطعه G4513-80213) و یک درگاه تزریق split/splitless انجام شد. پیکربندی دستگاه و شرایط آنالیز در جدول 2 (ستون CP-Sil 88 برای FAME)، جدول 3 (ستون DB-FastFAME)، جدول 4 (ستون با بازده بالای DB-FastFAME) و جدول 5 (ستون DB-FATWAX UI) خلاصه شده است. جدول 6 سایر ملزومات استفاده شده در این مطالعه را فهرست می کند.
نتایج و بحث
فازهای سیانوپروپیل سیلوکسان بسیار قطبی، مانند CP-SIL 88 برای FAME یا HP-88، به طور خاص برای بهبود جداسازی اسیدهای چرب FAME سیس و ترانس طراحی شده اند. اثربخشی ستون های سیانوپروپیل سیلوکسان با قطبیت بالا برای تعیین اسیدهای چرب ترانس قبلا با موفقیت نشان داده شده است. با این حال، در الگوی Elution تجزیه و تحلیل FAME های 37 جزئی در بسیاری از کاربردها، همپوشانی قابل توجهی در زنجیره کربنی وجود دارد، به عنوان مثال C18:3n6 یا C18:3n3 و C20:0؛ C20:3n3، C22:1n9 و C20:4n6.3. این می تواند منجر به مشکلات شناسایی پیک شود.
شکل 1 جداسازی بهینه روش استاندارد مرجع 37 جزئی FAME را با استفاده از ستون CP-Sil 88 برای FAME و GC-FID نشان می دهد که منجر به انتخاب پذیری عالی می شود. همه 37 جزء در یک اجرا با خط پایه از هم جدا شدند. برای دستیابی به تفکیک پذیری خوب برای همه ترکیبات در مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME، از یک ستون کروماتوگرافی گازی 100 متری CP-Sil 88 برای FAME استفاده شد و زمان تجزیه و تحلیل بیش از 70 دقیقه بود.
همانطور که در شکل 1 مشاهده می کنید، ستون CP-Sil 88 برای FAME جداسازی عالی از تمام 37 جزء FAME را در مخلوط استاندارد FAME 37 جزئی نشان می دهد. با این حال، این روش با زمان اجرا طولانی (بیش از 70 دقیقه) همراه است که می تواند برای برخی از کاربردها محدودیت ایجاد کند.
یکی دیگر از جایگزین های رایج برای تجزیه و تحلیل این نوع FAME ها در مخلوط های پیچیده، ستون های کروماتوگرافی گازی با فاز میانی سیانوپروپیل است. ستون کروماتوگرافی گازی J&W DB-FastFAME به طور خاص برای جداسازی سریع مخلوط های FAME طراحی شده است.
این نوع ستون ها به دلیل برهمکنش قوی‌تر ایزومرهای سیس با سیانو-دیپول، باعث می‌شوند ایزومرهای ترانس قبل از ایزومرهای سیس خارج شوند. بنابراین، این ستون ها می توانند تا حدی جداسازی بین FAME های سیس و ترانس را انجام دهند.
ستون کروماتوگرافی گازی J&W DB-FastFAME
برای تجزیه و تحلیل مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME، یک ستون DB-FastFAME با ابعاد 30 متر طول، 0.25 میلی متر قطر داخلی و 0.25 میکرومتر ضخامت فیلم انتخاب شد. شکل 2 کروماتوگرم نمونه ای GC-FID را نشان می دهد که در آن تمام ترکیبات موجود در مخلوط استاندارد به خوبی از هم جدا شده اند و زمان تجزیه و تحلیل کمتر از 18 دقیقه بود.
یکی از راه های بهبود بهره وری بدون افت عملکرد اندازه گیری، استفاده از یک ستون کروماتوگرافی گازی با بازده بالا و قطر داخلی 0.18 میلی متر است. دلیل آن این است که با کاهش قطر داخلی ستون، بازده ستون در هر متر افزایش می یابد و در عین حال حفظ تفکیک پذیری، طول ستون را می توان کاهش داد.
استفاده از هیدروژن به عنوان گاز حامل، با تفکیک پذیری تقریباً معادل، تجزیه و تحلیل را سریعتر انجام می دهد زیرا سرعت بهینه جریان خطی حامل گاز به دلیل نفوذپذیری بالاتر هیدروژن، بیشتر است. شکل 3 جداسازی مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME را بر روی ستون DB-FastFAME با ابعاد 20 متر طول، 0.18 میلی متر قطر داخلی و 0.20 میکرومتر ضخامت فیلم نشان می دهد.
این روش تمام ترکیبات موجود در مخلوط استاندارد (تفکیک پذیری > 1.5) از جمله جفت های بحرانی AOAC را به طور کامل جدا کرد و زمان اجرا را به کمتر از 8 دقیقه کاهش داد، که نشان می دهد با استفاده از ستون های با بازده بالا بدون به خطر انداختن تفکیک پذیری، امکان دستیابی به سرعت بالای نمونه گیری وجود دارد.
همانطور که در شکل 2 و 3 مشاهده می شود، ترتیب خروج دو جفت از ترکیبات (EPA/c22:0 و DHA/C24:1) متفاوت است. تغییر فشار ورودی در یک برنامه دمایی ممکن است دمای موثر تجربه شده توسط ترکیبات را تغییر دهد. روش تجزیه و تحلیل EPA و DHA در مخلوط های پیچیده، با تغییر ترتیب خروج این دو جفت ترکیب در ستون DB-FastFAME، در صورت تغییر گاز حامل، استفاده از فشار ورودی و ضخامت فیلم متفاوت، قابل بهینه سازی است.
ستون کروماتوگرافی گازی J&W DB-FATWAX Ultra Inert (UI)
به طور معمول، ستون های PEG (ستون های WAX) برای تجزیه و تحلیل FAME روغن ها و چربی های خوراکی کلاسیک، روغن ماهی های دریایی و نمونه های گوشت، از جمله تعیین اسید بوتیریک در چربی شیر مفید هستند. دلیل این امر این است که آنها ایزومرهای FAME را بر اساس طول زنجیره کربنی و درجه عدم اشباع جدا می کنند. اما برخی همپوشانی ها وجود دارد، به عنوان مثال، C20:3 n6 و C21:1 تفکیک نمی شوند و C22:6 و C24:1 نیز همزمان خارج می شوند و هیچ جداسازی برای ایزومرهای سیس و ترانس در یک ستون WAX سنتی به دست نمی آید.
ستون کروماتوگرافی گازی J&W DB-FATWAX Ultra Inert (UI) با عملکرد بهبود یافته معرفی شد. شکل 4 جداسازی مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME را بر روی ستون DB-FATWAX Ultra Inert با ابعاد 30 متر طول، 0.25 میلی متر قطر داخلی و 0.25 میکرومتر ضخامت فیلم نشان می دهد. جداسازی خوبی به دست می آید، به جز یک جفت از ایزومرهای سیس و ترانس C18:1؛ تفکیک پذیری 0.56 است. این جفت ترکیبات به طور معمول در سایر ستون های WAX با هم خارج می شوند و به صورت یک پیک ظاهر می شوند.
جفت دیگری از ایزومرهای سیس و ترانس، C18:2 سیس و C18:2 ترانس، را می توان با خط پایه در یک ستون DB-FATWAX UI GC جدا کرد، که نشان می دهد ستون های DB-FATWAX UI برخی از جداسازی های ایزومرهای سیس و ترانس را با خروج ایزومر سیس در ابتدا ارائه می دهند.
گروهی از اسیدهای چرب چند غیراشباع (PUFAs) که دارای چندین باند دوگانه مهم برای تغذیه انسان هستند، اسیدهای چرب امگا 3 و امگا 6 مانند C20:5n3 (EPA)، C22:6n3 (DHA) و C20:4n6 (ARA) می باشند. شکل 4 تفکیک پذیری خوبی را برای این FAME های امگا 3 و امگا 6 نشان می دهد. شکل های 5 تا 7 نمونه هایی از جداسازی به دست آمده برای مخلوط های PUFA را نشان می دهند. FAME های کلیدی از جمله EPA و DHA را می توان به راحتی شناسایی و کمی سازی کرد.
نتیجه گیری
این مقاله روشی بهبود یافته برای آنالیز مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME را با استفاده از سه نوع ستون مویینه مخصوص تجزیه و تحلیل FAME معرفی می کند.
فاز سیانوپروپیل سیلوکسان با قطبیت بالا، ستون Agilent J&W CP-Sil 88 برای FAME، به دلیل جداسازی ایزومرهای سیس و ترانس، به عنوان ستون ترجیحی انتخاب شد. در این پژوهش جداسازی کامل تمام اجزای موجود در مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME بر روی ستون CP-Sil 88 برای FAME نشان داده شده است.
یک ستون کروماتوگرافی گازی Agilent J&W DB-FastFAME نیز می تواند تفکیک پذیری عالی را برای تجزیه و تحلیل مخلوط استاندارد 37 جزئی FAME ارائه دهد. یک ستون DB-FastFAME با قطر داخلی 0.18 میلی متر و بازده بالا می تواند به طور کامل تمام ترکیبات موجود در مخلوط استاندارد را از هم جدا کند و زمان آنالیز را به کمتر از 8 دقیقه کاهش دهد. این ستون امکان دستیابی به سرعت بالای نمونه گیری را با استفاده از ستون های با بازده بالا و بدون افت تفکیک پذیری فراهم می کند.
ستون Agilent J&W DB-FATWAX UI برای اکثر FAME های اشباع شده و چند غیراشباع، انتخابگری منحصر به فردی را ارائه می دهد. به جز ایزومرهای سیس و ترانس C18:1، سایر FAME ها از جمله ایزومرهای سیس و ترانس C18:2 و همچنین ARA، EPA و DHA به خوبی از هم جدا می شوند. این ستون برای تجزیه و تحلیل روغن ماهی، چربی گوشت و اسیدهای چرب کلیدی امگا 3 و امگا 6 ایده آل است.