چکیده
ناخالصی‌های نیتروزامین، محصولات جانبی هستند که در طی فرآیند ساخت داروهای شیمیایی، به مقدار بسیار کم تولید می‌شوند. این ناخالصی‌ها به عنوان ترکیبات بالقوه جهش‌زا و احتمالا سرطان‌زا در صورت مصرف طولانی مدت طبقه‌بندی می‌شوند. بنابراین، تعیین سطوح آنها در محصولات دارویی نهایی با حساسیت و اطمینان بالا بسیار مهم است. این یادداشت کاربردی، عملکرد ارزیابی شده کمی‌سازی هشت ناخالصی نیتروزامین را با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع-طیف سنجی جرمی سه رباعی Agilent 6495D (LC/TQ 6495D) همراه با سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) Agilent 1290 Infinity II bio و منبع یونش شیمیایی فشار اتمسفر (APCI) Agilent توصیف می‌کند.
مقدمه
فراخوان جمع‌آوری چندین داروی دارویی، از جمله داروهای مسدودکننده گیرنده آنژیوتانسین II (ARB)، باعث شد تا آلاینده‌های نیتروزامین مورد توجه سازمان‌های نظارتی قرار گیرند. [1] آلاینده‌های نیتروزامین، محصولات جانبی هستند که در طی فرآیند تولید داروهای شیمیایی به وجود می‌آیند. آنها جزء گروهی از “آلاینده‌های نگران کننده” طبقه‌بندی می‌شوند که به عنوان آلاینده‌های بالقوه جهش‌زا و احتمالا سرطان‌زا در صورت مصرف طولانی مدت شناخته می‌شوند.
در این یادداشت کاربردی، یک آنالیز جامع از هشت ترکیب نیتروزامین با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع-طیف سنجی جرمی سه رباعی Agilent 6495D همراه با سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) Agilent 1290 Infinity II و منبع یونش شیمیایی فشار اتمسفر (APCI) Agilent انجام شد. این مطالعه نشان داد که ترکیبات زیر را می‌توان در سطوح بسیار پایینی تعیین کرد:
- N-نیتروزودی متیل آمین (NDMA)
- N-نیتروزومورفولین (NMOR)
- N-نیتروزومتیل اتیل آمین (NMEA)
- N-نیتروزوپیرولیدین (NPYR)
- N-نیتروزودی اتیل آمین (NDEA)
- N-نیتروزوپیریدین (NPIP)
- N-نیتروزودی-n-پروپیل آمین (NDPA)
- N-نیتروزودی-n-بوتیل آمین (NDBA)
مواد و روش ها
مواد شیمیایی و استانداردها
تمام معرف‌ها و حلال‌های استفاده شده در تجزیه و تحلیل از درجه خلوص LC/MS بودند. آب فوق خالص با استفاده از سیستم Milli-Q Integral به همراه یک دستگاه پولیشر LC-Pak و یک کارتریج فیلتر غشایی نقطه‌ای 0.22 میکرومتری (EMD Millipore، Billerica، MA، USA) تولید شد. استانداردهای حاوی هشت نیتروزامین NDMA، NDEA، NMOR، NMEA، NPYR، NPIP، NDPA و NDBA از Agilent (شماره قطعه US-113N-1) خریداری شد.
آماده سازی نمونه
استانداردهای نیتروزامین به حلال خالی (متانول:آب 10:90) در نه سطح غلظت مختلف از 0.0125 تا 10 نانوگرم بر میلی‌لیتر افزوده شد.
آماده سازی ماتریس ماده موثره دارویی (API) به شرح زیر انجام شد:
100 میلی گرم داروی لوزارتان پتاسیم در 2 میلی لیتر حلال (متانول: آب 50:50) حل شد و به مدت 30 دقیقه با سونوگرافی (اولتراسونیک) هموژن گردید. سپس نمونه ها به مدت 10 دقیقه در دور 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. مایعات رویی جمع آوری شده و سپس با آب 1:5 رقیق شدند. استانداردهای نیتروزامین به ماتریس API آماده شده در غلظت هایی از 0.005 تا 20 نانوگرم بر میلی لیتر اضافه شد.
دستگاه‌ها
جداسازی نمونه با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا زیستی (HPLC) Agilent 1290 Infinity II انجام شد که از ماژول‌های زیر تشکیل شده است:
- پمپ سرعت بالای زیستی Agilent 1290 Infinity II (G7132A)
- نمونه‌گیر چندگانه زیستی Agilent 1290 Infinity II با ترموستات (G7137A)
- ترموستات چند ستونی Agilent 1290 Infinity II (G7116B)
سیستم کروماتوگرافی مایع به طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 6495D (LC/MS) (G6495D) با منبع یونش شیمیایی فشار اتمسفر (APCI) (G1947B) متصل شده است. نسخه 12.1 نرم‌افزار ایستگاه کاری Agilent MassHunter برای کسب داده استفاده شد. تست‌های این یادداشت کاربردی را می‌توان با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا زیستی 1290 Infinity II یا سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 1290 Infinity II انجام داد.
روش‌ها
شرایط و پارامترهای LC/MS در جدول‌های ۱ و ۲ ارائه شده است. تنظیمات MRM برای ترکیبات در جدول 3 فهرست شده است. با استفاده از ویژگی حالت iFunnel اختصاصی MRM MassHunter 12.1، مشخص شد که تنظیم حالت شکننده (Fragile) بالاترین فراوانی را برای همه ترکیبات در این مطالعه به ارمغان می‌آورد. برای تجزیه و تحلیل منحنی کالیبراسیون، از برازش خطی با صرفنظر از مبدأ و وزن‌دهی 1/x استفاده شد.
نتایج و بحث
تجزیه و تحلیل منحنی کالیبراسیون
برای ارزیابی عملکرد کمی‌سازی نیتروزامین‌ها، منحنی‌های کالیبراسیون هشت ترکیب نیتروزامین در غلظت‌های 0.0125، 0.025، 0.05، 0.1، 0.25، 0.5، 1، 2.5، 5 و 10 نانوگرم بر میلی‌لیتر در حلال بلانک (متانول: آب 10:90) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.
نتایج تجزیه و تحلیل به شرح زیر است:
- جداسازی کروماتوگرافی و شکل پیک عالی برای تمام آنالیت‌ها به شرح زیر مشاهده شد:
- NDMA و NDEA به طور کامل از هم جدا شدند.
- NMOR و NMEA به طور کامل از هم جدا شدند.
- NPYR و NPIP به طور کامل از هم جدا شدند.
- NDPA و NDBA به طور کامل از هم جدا شدند.
- خطی‌سازی کمی عالی برای سطوح آزمایش‌شده با R2 > 0.99 برای هر هشت آنالیت مشاهده شد (شکل 2).
- دقت و صحت فوق‌العاده در تمام سطوح آزمایش‌شده، از جمله سطوح حد پایین کمی (LLOQ) مشاهده شد (جدول 4).
- حساسیت تحلیلی بالا، با LLOQ ≤ 0.0125 نانوگرم بر میلی‌لیتر (12.5 ppt) برای همه آنالیت‌های هدف (جدول 4) مشاهده شد.
کمی سازی در ماتریس دارویی لوزارتان پتاسیم
به منظور بررسی عملکرد تحلیلی ناخالصی‌های نیتروزامین در محصولات دارویی، استانداردهای نیتروزامین در غلظت‌هایی بین 0.005 تا 20 نانوگرم بر میلی‌لیتر به عصاره دارویی لوزارتان پتاسیم اضافه شدند (spiked). نتایج نشان داد که هر هشت ترکیب نیتروزامین در غلظت 0.03 نانوگرم بر میلی‌لیتر در ماتریس دارو با اطمینان بالا قابل کمی‌سازی هستند. حساسیت‌های تحلیلی برای هر هشت آنالیت به خوبی پایین‌تر از حد مجاز نیتروزامین مورد نیاز سازمان‌های نظارتی بود [2، 3]. NDMA اغلب یک ترکیب چالش‌برانگیز برای تجزیه و تحلیل ناخالصی‌های نیتروزامین است. شکل ۳ کروماتوگرافی‌های نماینده NDMA را در نمونه خالی ماتریس، 0.03 نانوگرم بر میلی‌لیتر و 0.12 نانوگرم بر میلی‌لیتر در عصاره دارویی 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر با تکرارپذیری نشان می‌دهد. این سیستم، پاسخ، نسبت سیگنال به نویز (S/N) و تکرارپذیری عالی NDMA را در غلظت‌های پایین در ماتریس دارو بر روی LC/TQ مدل 6495D نشان داد.
نتیجه گیری
این یادداشت کاربردی نشان می‌دهد که سیستم کروماتوگرافی مایع-طیف‌سنجی جرمی سه رباعی مدل Agilent 6495D می‌تواند ناخالصی‌های نیتروزامین را در سطوح پایین تا 0.01 نانوگرم بر میلی‌لیتر یا 10 ppt، که پایین‌تر از حد مجاز مورد نیاز سازمان‌های نظارتی است، با اطمینان بالا کمی‌سازی کند. این روش با برخی تغییرات در شرایط کروماتوگرافی بر اساس الگوی شویش ماده دارویی یا محصول دارویی مورد نظر، قابل استفاده برای کمی‌سازی این ناخالصی‌ها در محصولات دارویی مختلف از دسته مسدودکننده‌های گیرنده آنژیوتانسین II (ARB) است.
