جداسازی و تعیین کمی همزمان هفت داروی بدون نسخه با استفاده از ستون Agilent InfinityLab Poroshell 120
چکیده
یک روش كروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا فاز معكوس، باینری و عمومی (RP-HPLC) با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع Agilent 1260 Infinity II برای تعیین همزمان هفت ماده مؤثره دارویی توسعه و تأیید شد. این مواد شامل استامینوفن، دکسترومتورفان، دوکسیل آمین، فنیل افرین، گایفنسین، کافئین و آسپرین می شوند.
جدا سازی در زمان اجرای 5 دقیقه روی یک ستون Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8، 2.1 × 150 میلی متر، 2.7 میکرومتری با استفاده از یک روش ساده گرادیان خطی با دو فاز متحرک به دست آمد. فاز متحرک A محلول 0.1 درصد اسید تری فلوئورواتیک در آب تصفیه شده و فاز متحرک B مخلوطی از استونیتریل و متانول (حجم به حجم 750:250) با 0.1 درصد اسید تری فلوئورواتیک بود. سرعت جریان 0.35 میلی لیتر در دقیقه و حجم تزریق 5 میکرولیتر تنظیم شد.
شناسایی با استفاده از آشکارگر آرایه دیودی در طول موج 280 نانومتر انجام شد. به عنوان بخشی از تأیید روش، اختصاصیت، خطی بودن و دقت مورد بررسی قرار گرفت.
روش عمومی RP-HPLC پیشنهادی برای آنالیز روتین محصولات بدون نسخه (OTC) سرماخوردگی و سرفه قابل استفاده است.
مقدمه
داروهای بدون نسخه (OTC) به راحتی در داروخانه ها و فروشگاه های عمومی در دسترس مصرف کنندگان قرار می گیرند و برای استفاده نیازی به مجوز پزشکان ندارند. این داروها در اشکال مختلفی از جمله قرص، کپسول مایع و شربت عرضه می شوند و به طور کلی برای مصرف خود به خود بی خطر در نظر گرفته می شوند. بسیاری از شرکت های دارویی با ترکیب دو یا چند ماده دارویی فعال در اشکال تک دوز مانند قرص، ژل نرم و شربت مایع برای سهولت مصرف (به عنوان مثال پاراستامول که به عنوان استامینوفن (ACE) و آسپرین (ASP) نیز شناخته می شود، همچنین به عنوان اسید استیل سالیسیلیک شناخته می شود) داروهای OTC تولید می کنند.
بررسی منابع نشان می دهد که HPLC به دلیل در دسترس بودن گسترده و زمان تجزیه و تحلیل سریع، روش ترجیحی برای بسیاری از محققان هنگام تجزیه و تحلیل داروهای سرماخوردگی و سرفه است. انواع مختلف قرص های چند جزئی، ژل های نرم و فرمولاسیون های مایع حاوی اجزای فعال مانند ACE، دکسترومتورفان (DEX) و کافئین (CAF) در بازار وجود دارد و به طور رایج برای رفع علائم سرماخوردگی و سرفه استفاده می شود. در نتیجه، بسیاری از محققان تلاش خود را بر توسعه روش هایی متمرکز کرده اند که بتوانند به طور همزمان یکی یا چند مورد از این مواد فعال را در فرمولاسیون های مختلف شناسایی و تعیین کمیت کنند. پروتکل های مختلفی با استفاده از امکانات تحلیلی مختلف از جمله کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا گزارش شده است.
هدف اصلی این مطالعه، توسعه یک روش HPLC عمومی، سریع و سرراست با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع Agilent 1260 Infinity II برای تعیین کمی همزمان هفت ترکیب خاص بود. تا آنجا که ما می دانیم، تنها یک روش HPLC تک مرحله ای برای تخمین همزمان این هفت ماده فعال با زمان تجزیه و تحلیل 20 دقیقه قبلاً گزارش شده است. با توجه به این موضوع، یک پروتکل HPLC ساده، سریع و مقرون به صرفه برای تخمین همزمان این ترکیبات توسعه و تأیید شد.
ستون های با ذرات متخلخل سطحی Agilent بازده بالایی را در فشار پایین‌تر نسبت به ستون‌های همتراز با ذرات کاملاً متخلخل خود ایجاد می‌کنند. این امر عمدتاً به دلیل مسافت انتقال جرم کوتاهتر و توزیع اندازه ذرات بسیار باریکتر ذرات موجود در ستون است. روند فعلی با ذرات متخلخل سطحی، کاهش اندازه ذرات برای بهبود بیشتر بازده است. از بازده بالاتر می توان برای سرعت بخشیدن به تجزیه و تحلیل ها یا بهبود نتایج با افزایش تفکیک پذیری و حساسیت استفاده کرد. بدین ترتیب، ستون های Agilent InfinityLab Poroshell 120 برای این روش انتخاب شدند.
در طول تأیید روش، تأثیر تغییرات سرعت جریان و دمای آون ستون بر جداسازی این ترکیبات مورد بررسی قرار گرفت.
آزمایش
این مطالعه از یک سیستم کروماتوگرافی مایع 1260 Infinity II LC همراه با نرم افزار Agilent OpenLab CDS استفاده کرد. سیستم در پیکربندی استاندارد مورد استفاده قرار گرفت و جزئیات دستگاه در جدول 1 ذکر شده است. استامینوفن، کافئین، آسپرین، دکسترومتورفان، دوکسیل آمین، فنیل افرین و گایفنسین از Sigma-Aldrich خریداری شد. ستون Poroshell 120 EC-C8 با ابعاد 2.1 × 150 میلی متر و اندازه ذرات 2.7 میکرومتری (شماره قطعه 693775-906) مورد ارزیابی قرار گرفت. اسید تری فلوئورواتیک (TFA) از Sigma-Aldrich خریداری شد. متانول و استونیتریل (درجه HPLC) از شرکت Honeywell (Burdick and Jackson) خریداری شد. یک سیستم Milli-Q (Millipore) آب 18 مگااهم بر سانتی متر را تامین کرد که از فیلتر 0.2 میکرومتری عبور داده شد.
تهیه محلول های استاندارد اولیه
در ابتدا، تمامی محلول های اولیه برای به دست آوردن محلول های شفاف در متانول تهیه شدند و سپس برای رسیدن به غلظت نهایی ACE (80 میکروگرم بر میلی لیتر)، DEX (300 میکروگرم بر میلی لیتر)، DOX (125 میکروگرم بر میلی لیتر)، PHE (80 میکروگرم بر میلی لیتر)، ASP (80 میکروگرم بر میلی لیتر)، CAF (25 میکروگرم بر میلی لیتر) و GUA (50 میکروگرم بر میلی لیتر)، با 0.1 درصد اسید تری فلوئورواتیک (فاز متحرک A) به محلول مخلوط استاندارد آماده شده رقیق شدند.
نتایج و بحث
به طور کلی، داروهای بدون نسخه سرماخوردگی و سرفه در ترکیبات مختلف و انواع مختلف فرمولاسیون موجود هستند. هدف اولیه توسعه این روش، ایجاد یک روش تحلیلی سریع و ساده برای جداسازی ترکیبات با تقارن پیک خوب و تفکیک پذیری بود.
برای بهینه سازی شرایط کروماتوگرافی، توسعه روش با انتخاب ترکیبات بافر و فاز متحرک آغاز شد.
آزمایش ۱
آزمایش ۱ برای انتخاب بافر سازگار با LC/MS با اصلاح کننده های آلی انجام شد. برای فاز متحرک A از ۰.۱% اسید تری فلوئورواتیک در آب تصفیه شده به عنوان بافر و از ۱۰۰% متانول به عنوان فاز متحرک B استفاده شد. ستون Poroshell 120 EC-C8 (2.1 × 150 میلی متر، 2.7 میکرومتری) برای جداسازی ترکیبات انتخاب شد. شکل ۲ شرایط کروماتوگرافی را نشان می دهد.
محلول مخلوط استاندارد با استفاده از 5 میکرولیتر به سیستم LC 1260 Infinity II تزریق شد و پاسخ آشکارساز با نرم افزار OpenLab CDS مانیتور شد. همه پیک ها (PHE، ACE، CAF، DOX، GUA، ASP و DEX) در مدت زمان 17 دقیقه از زمان اجرا خارج شدند (شکل 2).
برای انتخاب طول موج، استاندارد مخلوط به آشکارگر آرایه دیودی تزریق شد. حداکثر جذب برای PHE (271 نانومتر)، ACE (242 نانومتر)، CAF (203 و 271.0 نانومتر)، DOX (201 و 260.0 نانومتر)، GUA (222 و 272 نانومتر)، ASP (225 و 274 نانومتر) و DEX (277 نانومتر) مشاهده شد.
اکثر اجزا حداکثر جذب را در محدوده 270 تا 280 نانومتر نشان دادند و همه پیک ها در 280 نانومتر پاسخ خوبی را نشان دادند. پارامترهای مناسب بودن سیستم (مانند فاکتور کشیدگی و صفحات تئوری) رضایت بخش بودند، اما تفکیک پذیری بین CAF و DOX کافی نبود و زمان اجرای روش کاهش یافت.
آزمایش 2
آزمایش ۲ با جایگزینی فاز متحرک B با استونیتریل (۱۰۰٪) در حالی که سایر شرایط کروماتوگرافی بدون تغییر باقی ماند، انجام شد. محلول مخلوط استاندارد به سیستم LC 1260 Infinity II تزریق شد و کروماتوگرافی در نرم افزار OpenLab CDS پردازش شد. تمامی پیک ها (PHE، ACE، CAF، DOX، GUA، ASP و DEX) در مدت زمان 14 دقیقه از زمان اجرا خارج شدند (شکل 3). پارامترهای مناسب بودن سیستم (فاکتور کشیدگی، صفحات تئوری و تفکیک پذیری) بین همه پیک ها رضایت بخش بودند، اما زمان اجرای روش نیاز به کاهش داشت.
آزمایش 3
برای کاهش زمان اجرای روش، آزمایش 3 با تغییر برنامه گرادیان (شکل 4) و سرعت جریان (به 0.35 میلی لیتر در دقیقه) انجام شد. سایر شرایط کروماتوگرافی همانند آزمایش 1 باقی ماند. محلول مخلوط استاندارد به سیستم 1260 Infinity II تزریق شد و پاسخ آشکارساز با نرم افزار OpenLab CDS مانیتور شد. همه پیک ها (PHE، ACE، CAF، DOX، GUA، ASP و DEX) در مدت زمان 5.2 دقیقه از زمان اجرا خارج شدند (شکل 4). پارامترهای مناسب بودن سیستم مانند فاکتور کشیدگی و صفحات تئوری رضایت بخش بودند، اما تفکیک پذیری بین PHE و ACE و CAF و DOX برای ادغام پیک ها کافی نبود.
آزمایش 4
برای افزایش تفکیک پذیری بین PHE و ACE و همچنین CAF و DOX، فاز متحرک B برای شامل کردن مخلوطی از 0.1% اسید تری فلوئورواتیک در استونیتریل و متانول (75:25 حجمی به حجمی) اصلاح شد. برنامه گرادیان نیز دوباره تغییر کرد (شکل 5). سایر شرایط کروماتوگرافی همانند آزمایش 1 باقی ماند. محلول مخلوط استاندارد به سیستم LC 1260 Infinity II تزریق شد و پاسخ آشکارساز با نرم افزار OpenLab CDS مانیتور شد.
تمامی پیک ها (PHE، ACE، CAF، DOX، GUA، ASP و DEX) در مدت زمان پنج دقیقه از زمان اجرا خارج شدند (شکل 5). پارامترهای مناسب بودن سیستم (فاکتور کشیدگی، صفحات تئوری و تفکیک پذیری بین پیک ها) رضایت بخش بودند. در طول موج انتخاب شده، هیچ تداخلی از حلال رقیق کننده (فاز متحرک A) وجود نداشت. روش پیشنهادی RP-HPLC به عنوان روش برتر و سریعتر برای تعیین هفت ماده فعال در یک فرآیند واحد ثابت شد.
پوشش کروماتوگرافی های بهینه سازی شده روش در شکل 6 نشان داده شده است و شرایط نهایی LC در جدول 2 ذکر شده است.
تأیید روش
خطی بودن
خطی بودن روش طبق دستورالعمل ICH Q2 (R1) ارزیابی شد. این کار شامل تهیه شش سطح غلظت برای هر آنالیت هدف بود:
- استامینوفن (ACE): 32 تا 112 میکروگرم بر میلی لیتر
- دکسترومتورفان (DEX): 120 تا 480 میکروگرم بر میلی لیتر
- دوکسیل آمین (DOX): 48 تا 168 میکروگرم بر میلی لیتر
- فنیل افرین (PHE): 32 تا 112 میکروگرم بر میلی لیتر
- آسپرین (ASP): 32 تا 112 میکروگرم بر میلی لیتر
- کافئین (CAF): 10 تا 35 میکروگرم بر میلی لیتر
- گایفنسین (GUA): 20 تا 70 میکروگرم بر میلی لیتر
تمام محلول ها در رقیق کننده (فاز متحرک A) تهیه شدند. هر غلظت از مخلوط استاندارد سه بار به سیستم HPLC تزریق شد و میانگین مساحت پیک برای محاسبه منحنی کالیبراسیون استفاده شد. نمودارهای کالیبراسیون با رسم مساحت پیک در مقابل غلظت داروهای استاندارد به دست آمد.
مقدار ضریب رگرسیون (R²) برای همه ترکیبات 0.9999 بود که نشان دهنده درجه قابل قبولی از خطی بودن است. کروماتوگرافی های خطی بودن و منحنی های کالیبراسیون به ترتیب در شکل های 7 و 8 ارائه شده اند (در متن ترجمه شده ارائه نشده اند).
تأیید روش
ویژگي (Specificity)
ویژگي روش با تزریق یک کور (فاز متحرک A) تأیید شد. تداخلی در زمان ماندگاری پیک های آنالیت مشاهده نشد. روش بهینه سازی شده قادر بود پیک های حلال رقیق کننده را از زمان ماندگاری آنالیت های ACE، DEX، DOX، ASP، PHE، CAF و GUA جدا کند.
دقت (Precision)
دقت روش با تهیه شش نمونه جداگانه از مخلوط همگن محلول استاندارد، شامل استامینوفن (80 میکروگرم بر میلی لیتر)، دکسترومتورفان (300 میکروگرم بر میلی لیتر)، دوکسیل آمین (120 میکروگرم بر میلی لیتر)، آسپرین (80 میکروگرم بر میلی لیتر)، فنیل افرین (80 میکروگرم بر میلی لیتر)، کافئین (25 میکروگرم بر میلی لیتر) و گایفنسین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) انجام شد.
دقت روش بر اساس %RSD نتایج شش نمونه جداگانه تعیین شد. مقادیر %RSD در سطح غلظت 100٪ کمتر از 2.0٪ یافت شد. کروماتوگرافی های هم پوشانی دقت در شکل 9 نشان داده شده است.
قوام (Robustness)
برای ارزیابی استحکام روش بهینه سازی شده، شرایط کروماتوگرافی به عمد تغییر داده شد و محلول استاندارد به HPLC تزریق شد. سرعت جریان فاز متحرک به 0.30 و 0.40 میلی لیتر در دقیقه تغییر یافت و دمای ستون به 25 تا 35 درجه سانتیگراد تغییر کرد. در هر آنالیز یک پارامتر انتخاب شده تغییر داده شد، در حالی که سایر شرایط ثابت نگه داشته شد. هیچ تغییر قابل توجهی در نتایج مناسب بودن سیستم مشاهده نشد. کروماتوگرافی هم پوشانی استحکام در شکل 10 نشان داده شده است.
نتیجه گیری
یک روش گرادیان سریع و کم هزینه برای تجزیه و تحلیل هفت ماده موثره OTC ارائه شده است. این روش در یک سیستم Agilent 1260 Infinity II LC در دمای 35 درجه سانتیگراد و فشار تقریباً 350 بار (5365 پوند بر اینچ مربع) اجرا شد. زمان اجرای کروماتوگرافی تقریباً پنج دقیقه بود. سرعت جریان روش 0.35 میلی لیتر در دقیقه بود و مصرف فاز متحرک برای اجرای توالی تزریق بسیار کم بود (1.75 میلی لیتر به ازای هر تزریق).
