استفاده از روش‌های LC/MS/MS و GC/MS/MS برای سنجش سموم
چکیده
یک روش کاری جامع چند باقیمانده برای تعیین کمی همزمان بیش از ۱۰۰۰ باقیمانده سموم دفع آفات در گوجه فرنگی به منظور تسریع و ساده‌سازی آزمایش‌های معمول مواد غذایی در آزمایشگاه توسعه و اعتبارسنجی شد. این روش طیف وسیعی از باقی‌مانده‌های سموم را به طور همزمان در مدت زمان ۲۰ دقیقه تجزیه و تحلیل می‌کند و از یک روش آماده‌سازی نمونه واحد برای هر دو آنالیز LC/MS/MS و GC/MS/MS استفاده می‌کند که منجر به افزایش سرعت کار، ساده‌سازی تجزیه و تحلیل و کاهش هزینه‌های آزمایشگاه می‌شود. این روش کاری شامل آماده‌سازی نمونه، جداسازی کروماتوگرافی، آشکارسازی طیف‌سنجی جرمی (MS)، آنالیز داده و تفسیر داده با استفاده از سیستم‌های Agilent LC/MS/MS و GC/MS/MS است. برای آماده‌سازی نمونه، از کیت استخراج QuEChERS شرکت Agilent بدون نیاز به پاکسازی بیشتر استفاده شد. گذارهای ترکیبی و پارامترهای بهینه‌سازی‌شده مرتبط بر اساس پایگاه‌های داده MRM سموم Agilent برای هر دو جریان کاری LC/MS و GC/MS توسعه داده شدند. عملکرد روش کاری بر اساس دستورالعمل SANTE 11312/2021 بر اساس حد پایین تشخیص دستگاه (LOD)، خطی بودن منحنی کالیبراسیون، بازیافت و دقت با استفاده از استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس از ۰.۵ تا ۱۰۰ میکروگرم بر لیتر ارزیابی و تایید شد. بیش از ۹۸ درصد از آنالیت‌ها خطی بودن با R2 ≥ ۰.۹۹ را نشان دادند. دقت روش با استفاده از تکرارپذیری بازیافت (RSDr) ارزیابی شد. در سطح ۱۰ میکروگرم بر کیلوگرم، مقادیر RSDr برای ۹۸ درصد از ترکیبات در محدوده ۲۰ درصد بود. میانگین بازیافت شش تکرار فنی برای ۹۸ درصد از آنالیت‌های هدف در محدوده ۴۰ تا ۱۲۰ درصد قرار داشت.
مقدمه
سموم دفع آفات نقش مهمی در صنایع کشاورزی و مواد غذایی برای بهبود عملکرد محصول و تولید غذا ایفا می کنند. باقیمانده سموم در محصولات کشاورزی مانند میوه، سبزیجات یا غلات می تواند منجر به اثرات نامطلوب بر سلامتی و همچنین نگرانی های زیست محیطی شود.
سازمان‌های نظارتی حداکثر سطوح مجاز باقیمانده (MRL) را برای صدها سموم دفع آفات و متابولیت‌های آنها تعیین کرده‌اند. اکثر سطوح مجاز باقیمانده در سطوح بسیار پایینی از parts per billion (ppb) تنظیم می‌شوند، که به خصوص زمانی که صدها ماده به طور همزمان در ماتریس‌های پیچیده مواد غذایی غربالگری و تعیین کمیت می‌شوند، چالش‌های قابل توجهی را به وجود می‌آورد.
در اروپا، آزمایشگاه‌های تست سموم دفع آفات از دستورالعمل SANTE 11312/2021 پیروی می‌کنند. این دستورالعمل رویکردی منسجم برای کنترل سطوح مجاز باقی‌مانده‌ای که به طور قانونی در مواد غذایی یا خوراک دام مجاز هستند، تضمین می‌کند.
با توجه به تعداد زیاد سموم دفع آفات، تجزیه و تحلیل بسیار پیچیده است و اغلب نیازمند رویکردهای تحلیلی متعدد و فرآیندهای آزمایشگاهی پرکار است که منجر به هزینه‌های عملیاتی بالا و زمان پاسخگویی کند می‌شود.
در این مطالعه، تجزیه و تحلیل دقیق و قابل اعتمادی از بیش از 1000 باقیمانده سموم دفع آفات در گوجه‌فرنگی با استفاده از یک استخراج واحد QuEChERS برای آماده‌سازی نمونه توسعه داده شد. همانطور که در نمودار ون (شکل 1) نشان داده شده است، 764 ترکیب توسط LC/MS/MS و 341 ترکیب توسط GC/MS/MS تجزیه و تحلیل شدند. تجزیه و تحلیل GC/MS/MS شامل 84 ترکیبی است که می تواند با استفاده از LC/MS/MS نیز تعیین شود؛ بنابراین، این روش کاری در مجموع 1021 ماده منحصر به فرد را پوشش می دهد.این روش کاری که شامل آماده‌سازی نمونه، جداسازی کروماتوگرافی، آشکارسازی با طیف‌سنجی جرمی، تعیین کمی هدفمند و تفسیر نتایج است، به ساده‌سازی تجزیه و تحلیل معمول سموم دفع آفات کمک می‌کند و در نتیجه سرعت و بازدهی آزمایشگاه را افزایش می‌دهد. جزئیات مربوط به فرایندهای آماده‌سازی نمونه، تنظیم دستگاه و پارامترهای آنالیز داده مورد بحث قرار می‌گیرد و امکان تعیین کمی و تأیید باقی‌مانده‌های سموم را فراهم می‌سازد.
مواد شیمیایی و معرف‌های آزمایش
این بخش از مقاله به مواد شیمیایی و معرف‌هایی می‌پردازد که در آزمایش برای تعیین کمی بیش از 1000 باقیمانده سموم دفع آفات در گوجه فرنگی استفاده شده است.
مواد شیمیایی درجه LC-MS:
- استونیتریل (ACN)
- متانول (MeOH)
- آب
- فرمات آمونیوم
اسید فرمیک درجه LC-MS: خریداری شده از VWR
سایر حلال‌ها: درجه HPLC و خریداری شده از VWR و مرک
استانداردها و محلول‌ها:
- استانداردهای پیش مخلوط آماده مصرف سموم دفع آفات
- استانداردهای سفارشی سموم دفع آفات (از آژیلنت و آکوستاندرد)
- استاندارد سفارشی آلی (از آژیلنت)
- استانداردهای تک سم (از آکوستاندرد و LGC)
محلول‌های مادر (غلظت 1000 میلی گرم بر لیتر در استون): نگهداری در دمای -20 درجه سانتیگراد
** مخلوط‌های استاندارد میانی:** تهیه شده از محلول‌های مادر و استفاده شده برای آماده‌سازی نمونه‌های کنترل کیفیت (QC) پیش اسپایک شده، استانداردهای کالیبراسیون حلال و کالیبراسیون مطابق با ماتریس
استانداردهای کالیبراسیون: در صورت عدم استفاده فوری، به صورت تازه تهیه شده و در یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری می‌شوند.
آماده‌سازی استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس
در این مطالعه از استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس (استانداردهای پس اسپایک‌شده) برای ارزیابی عملکرد روش کاری استفاده شد. ابتدا یک نمونه خالی از گوجه فرنگی (بدون سم) به عنوان ماتریس خالی تهیه گردید. برای آماده‌سازی سطوح کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس، محلول‌های استاندارد میانی با عصاره ماتریس خالی مخلوط شدند. این محلول‌ها به طور مستقیم برای تجزیه و تحلیل LC/MS/MS استفاده شدند و قبل از تجزیه و تحلیل GC/MS/MS با ضریب ۵ رقیق شدند.
استاندارد تطبیق داده شده با ماتریس در سطح ۱۰ ppb برای ارزیابی اثر ماتریس (ME) با مقایسه پاسخ‌ها با استاندارد حلال مربوطه استفاده شد.
دستگاه‌ها
مطالعه LC/MS/MS با استفاده از یک سیستم کروماتوگرافی مایع (LC) Agilent 1290 Infinity II متصل به یک طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 6470B انجام شد. اجزای سیستم LC/MS شامل موارد زیر بود:
- پمپ سرعت بالای Agilent 1290 Infinity II (G7120A)
- اتوسمپلر Agilent 1290 Infinity II (G7167B)
- ترموستات چند ستونی Agilent 1290 Infinity II (G7116B)
- طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 6470B (G6470B)
- پایگاه داده MRM دینامیک سموم دفع آفات Agilent (G1733CA)
- نرم افزار Agilent MassHunter (نسخه ۱۰.۱)
طیف‌سنج جرمی سه رباعی 6470 کوپل شده LC/MS به یک منبع یون الکترواسپری Agilent Jet Stream (AJS) مجهز شده بود و در حالت dMRM (طیف‌سنجی توده‌ای چند واکنشی پایش دینامیکی) کار می‌کرد. پارامترهای اصلی LC و MS در جدول ۱ ذکر شده‌اند. لطفاً برای پیکربندی دقیق LC/TQ به یادداشت کاربردی آژیلنت توسط Kornas مراجعه کنید.
مطالعه GC/MS/MS با استفاده از سیستم کروماتوگرافی گازی (GC) Agilent 8890 و طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 7010C انجام شد. اجزای سیستم GC/MS شامل موارد زیر بود:
- کروماتوگراف گازی Agilent 8890 (G3540A)
- نمونه‌گیر مایع خودکار Agilent 7693A (G4513A و GG4520A)
- طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 7010C (G7012C)
- پایگاه داده MRM آفت‌کش‌ها و آلاینده‌های محیطی (P&EP) Agilent MassHunter نسخه ۴.۰ (G9250AA)
- نرم افزار Agilent MassHunter (نسخه MassHunter acquisition 10.2 و نسخه MassHunter Quantitative Analysis 12.0)
کروماتوگراف گازی با نمونه‌گیر مایع خودکار (ALS) Agilent 7693A و سینی 150 محفظه‌ای پیکربندی شد. این سیستم از یک ورودی چندحالته (MMI) استفاده می‌کرد. جداسازی کروماتوگرافی با استفاده از پیکربندی سنتی Backflush میان‌ستونی 15 متر × 15 متر که در پایگاه داده P&EP توضیح داده شده است، انجام شد. بنابراین، از دو ستون کروماتوگرافی Agilent HP-5ms Ultra Inert (UI) (شماره قطعه 19091S-431UI) استفاده شد و قابلیت Backflush میان‌ستونی توسط واحد Purged Ultimate Union (PUU) آژیلنت که بین دو ستون 15 متری یکسان نصب شده است و ماژول سوئیچینگ پنوماتیک (PSD) روی کروماتوگراف گازی 8890 تأمین می‌گردد.
برای همخوانی با زمان‌های نگهداری در پایگاه داده P&EP 4.0 سیستم MassHunter، روش کسب داده بر اساس زمان ماندگاری قفل می‌شد. پارامترهای اصلی GC و MS در جدول ۲ ذکر شده‌اند. لطفاً برای پیکربندی دقیق GC/TQ به یادداشت کاربردی آژیلنت نوشته‌شده توسط کلینک مراجعه کنید.
تمام داده‌ها در حالت dMRM (طیف‌سنجی توده‌ای چند واکنشی پایش دینامیکی) به دست آمدند.
نتایج و بحث
توسعه روش‌های چند ترکیبی
بخش مهمی از این مطالعه، توسعه گذارهای dMRM برای تمام سموم دفع آفات موجود در پایگاه‌های داده آژیلنت بود. برای LC/MS/MS از پایگاه داده MRM دینامیک سموم دفع آفات آژیلنت استفاده شد. گذارهای MRM و همچنین ولتاژهای خردکننده، انرژی‌های برخوردی و قطبیت یونیزاسیون با استفاده از نرم‌افزار Agilent MassHunter Optimizer به‌وسیله تزریق جریانی بهینه شدند. تقریباً 1600 گذار MRM از 764 سم دفع آفات در روش نهایی dMRM ذخیره شد. عرض پیک‌های کروماتوگرافیک معمولی بین 8 تا 12 ثانیه بود. زمان چرخه انتخاب‌شده 490 میلی‌ثانیه تضمین می‌کرد که نقاط داده کافی در سراسر پیک‌های کروماتوگرافی برای تعیین کمیت دقیق و تأیید نتایج جمع‌آوری شود.
برای GC/MS/MS، بیشتر ترکیبات قبلاً در پایگاه داده MassHunter P&EP فهرست شده بودند. [4] ترکیباتی که گذارهای MRM آنها در این پایگاه داده فهرست نشده بود، با استفاده از MassHunter Optimizer برای GC/TQ توسعه داده شدند. MassHunter Optimizer با شروع یک روش GC که جداسازی خوب ترکیبات کروماتوگرافیک را فراهم می‌کند، ابتدا یون‌های پیشرو و یون‌های محصول را شناسایی می‌کند، سپس انرژی‌های برخورد را برای هر ترکیب امیدوارکننده پیشرو-محصول برای شناسایی بهترین پارامترهای MRM بهینه می‌کند. حدود 2100 گذار MRM از 341 سم دفع آفات در روش نهایی dMRM ذخیره شد. زمان چرخه انتخاب‌شده 300 میلی‌ثانیه تضمین می‌کرد که نقاط داده کافی در سراسر پیک‌های کروماتوگرافی برای تعیین کمیت دقیق و تأیید نتایج جمع‌آوری شود.
روش GC به زمان قفل‌‌شده برای مطابقت با زمان‌های نگهداری در پایگاه داده P&EP آژیلنت تنظیم شد که برای ایجاد بدون مشکل روش MS استفاده شد. استفاده از P&EP باعث سهولت و سرعت راه‌اندازی یک روش هدفمند dMRM شد. قفل شدن بر اساس زمان نگهداری به ستون یا دستگاه جدید اجازه می‌دهد تا زمان‌های نگهداری کاملاً با پایگاه داده MRM یا یک روش موجود مطابقت داشته باشد، به این ترتیب روش‌ها را می‌توان به راحتی از یک دستگاه به دستگاه دیگر و در سراسر جهان منتقل کرد. این امر باعث ساده‌سازی نگهداری روش و راه‌اندازی سیستم می‌شود.
برای برآورده کردن الزامات نظارتی برای شناسایی و تأیید به ترتیب توسط LC/MS/MS و GC/MS/MS، دو یا سه گذار MRM ویژه هدف برای هر سم در هر روش انتخاب شد. [1] داده‌ها در حالت dMRM (پایش چند واکنشی دینامیکی جرمی) به دست آمدند که این امکان را برای انجام سنجش‌های چند تجزیه‌ای بزرگ و تعیین کمیت دقیق پیک‌های باریک با توزیع زمان توقف خودکار و کارآمدترین فراهم می‌کند. علاوه بر این، dMRM به تحلیلگر این امکان را می‌دهد که به راحتی ترکیبات اضافی را اضافه یا حذف کند.
ارزیابی اثر ماتریس
اثرات ناشی از ماتریس نمونه اغلب رخ می‌دهد و باعث سرکوب یا افزایش پاسخ سیستم آشکارسازی طیف جرمی می‌شود.[1] اثر ماتریس (ME) با نسبت پاسخ هدف در استانداردهای تطبیق داده شده با ماتریس به استانداردهای حلال مربوطه ارزیابی شد. به طور معمول، معیار پذیرش سختی برای ME وجود ندارد، زیرا ME را می‌توان با منحنی کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس اصلاح کرد. با این حال، ME پارامتر مهمی برای ارزیابی حساسیت و قابلیت اطمینان روش است و سرکوب یا افزایش سیگنال کمتر از 20 درصد معمولاً به عنوان اثر ماتریس ناچیز در نظر گرفته می‌شود.[1]
در این مطالعه، اثر ماتریس با استفاده از یک استاندارد 10 میکروگرم بر لیتر در عصاره گوجه فرنگی (استاندارد پس اسپایک‌شده) بررسی شد و پاسخ آن با استاندارد حلال مربوطه مقایسه گردید. استاندارد 10 میکروگرم بر لیتر انتخاب شد، زیرا این کمترین سطح مجاز باقیمانده (MRL) برای سموم دفع آفات و متابولیت‌های آنهاست.
در غلظت 10 میکروگرم بر لیتر، بیش از 45 درصد از 1021 هدف در گوجه فرنگی اثر ماتریس قابل توجهی نشان دادند. بر اساس نتایج ارزیابی اثر ماتریس، در این مطالعه از استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس برای جبران اثر ماتریس استفاده شد.
تأیید عملکرد ورک فلو
معیارهای عملکرد ورک‌فلو بر اساس لینئاریته، حساسیت روش، بازیابی و دقت تأیید شدند. بچ آزمایش شامل حلال خالی، استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس، ماتریس خالی و نمونه‌های QC پیش اسپایک شده بود. برای نمونه‌های QC پیش اسپایک شده، شش تکرار فنی تهیه شد.
خطی بودن (Linearity): منحنی‌های کالیبراسیون برای همه ترکیبات با استفاده از استانداردهای تطبیق داده شده با ماتریس در محدوده 0.5 تا 100 میکروگرم بر لیتر و با هشت نقطه کالیبراسیون ایجاد شدند. رگرسیون خطی یا درجه دوم با وزن دهی 1/x و مبدأ نامشخص برای ایجاد منحنی کالیبراسیون استفاده شد. محدوده کالیبراسیون بر اساس نیازهای حساسیت LOQ و انتخابگری تعیین شد. نتایج در شکل 3 نشان می دهد که بیش از 98٪ از اهداف معیار لینئاریته منحنی کالیبراسیون R2 ≥ 0.99 را برآورده کرده اند. [1] تنها برخی از ترکیبات به دلیل عدم حساسیت در سطوح پایین کالیبراسیون یا اشباع شدن آشکارگر در سطوح غلظت بالا، محدوده کالیبراسیون اصلاح شده ای را نشان دادند.
حد تشخیص دستگاهی (LOD)
یک روش کاری حساس برای تجزیه و تحلیل باقیمانده سموم دفع آفات برای کاربران مفید است تا بتوانند عملیات روتین را مطابق با دستورالعمل‌های مختلف نظارتی انجام دهند. برای ارزیابی حساسیت روش از حد تشخیص دستگاهی (LOD) استفاده شد. LOD دستگاهی بر اساس استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس برای نسبت سیگنال به نویز (S/N) معادل 10 یا بیشتر تعیین شد. نسبت S/N با استفاده از ارتفاع پیک و الگوریتم پیک به پیک جاسازی شده در نرم افزار MassHunter Quantitative Analysis تعریف شد. ناحیه نویز به صورت دستی انتخاب شد و حداقل طول آن 0.1 دقیقه بود.
همانطور که در شکل 4 نشان داده شده، بیش از 97 درصد از ترکیبات هدف، حد تشخیص دستگاهی کمتر یا مساوی 10 میکروگرم بر لیتر را نشان دادند و حتی در سطح غلظت 1 میکروگرم بر لیتر، بیش از 88 درصد از ترکیبات دارای نسبت S/N معادل 10 یا بیشتر بودند. این نتایج حساسیت بالای هر دو سیستم، طیف‌سنج جرمی سه رباعی 6470 LC/MS و طیف‌سنج جرمی سه رباعی 7010 GC/MS را در برابر یک ماتریس پیچیده مانند عصاره خام QuEChERS گوجه فرنگی نشان می‌دهد.
آماده‌سازی استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس
در این مطالعه از استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس (استانداردهای پس اسپایک‌شده) برای ارزیابی عملکرد روش کاری استفاده شد. ابتدا یک نمونه خالی از گوجه فرنگی (بدون سم) به عنوان ماتریس خالی تهیه گردید. برای آماده‌سازی سطوح کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس، محلول‌های استاندارد میانی با عصاره ماتریس خالی مخلوط شدند. این محلول‌ها به طور مستقیم برای تجزیه و تحلیل LC/MS/MS استفاده شدند و قبل از تجزیه و تحلیل GC/MS/MS با ضریب ۵ رقیق شدند.
استاندارد تطبیق داده شده با ماتریس در سطح ۱۰ ppb برای ارزیابی اثر ماتریس (ME) با مقایسه پاسخ‌ها با استاندارد حلال مربوطه استفاده شد.
دستگاه‌ها
مطالعه LC/MS/MS با استفاده از یک سیستم کروماتوگرافی مایع (LC) Agilent 1290 Infinity II متصل به یک طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 6470B انجام شد. اجزای سیستم LC/MS شامل موارد زیر بود:
- پمپ سرعت بالای Agilent 1290 Infinity II (G7120A)
- اتوسمپلر Agilent 1290 Infinity II (G7167B)
- ترموستات چند ستونی Agilent 1290 Infinity II (G7116B)
- طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 6470B (G6470B)
- پایگاه داده MRM دینامیک سموم دفع آفات Agilent (G1733CA)
- نرم افزار Agilent MassHunter (نسخه ۱۰.۱)
طیف‌سنج جرمی سه رباعی 6470 کوپل شده LC/MS به یک منبع یون الکترواسپری Agilent Jet Stream (AJS) مجهز شده بود و در حالت dMRM (طیف‌سنجی توده‌ای چند واکنشی پایش دینامیکی) کار می‌کرد. پارامترهای اصلی LC و MS در جدول ۱ ذکر شده‌اند. لطفاً برای پیکربندی دقیق LC/TQ به یادداشت کاربردی آژیلنت توسط Kornas مراجعه کنید.
مطالعه GC/MS/MS با استفاده از سیستم کروماتوگرافی گازی (GC) Agilent 8890 و طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 7010C انجام شد. اجزای سیستم GC/MS شامل موارد زیر بود:
- کروماتوگراف گازی Agilent 8890 (G3540A)
- نمونه‌گیر مایع خودکار Agilent 7693A (G4513A و GG4520A)
- طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 7010C (G7012C)
- پایگاه داده MRM آفت‌کش‌ها و آلاینده‌های محیطی (P&EP) Agilent MassHunter نسخه ۴.۰ (G9250AA)
- نرم افزار Agilent MassHunter (نسخه MassHunter acquisition 10.2 و نسخه MassHunter Quantitative Analysis 12.0)
کروماتوگراف گازی با نمونه‌گیر مایع خودکار (ALS) Agilent 7693A و سینی 150 محفظه‌ای پیکربندی شد. این سیستم از یک ورودی چندحالته (MMI) استفاده می‌کرد. جداسازی کروماتوگرافی با استفاده از پیکربندی سنتی Backflush میان‌ستونی 15 متر × 15 متر که در پایگاه داده P&EP توضیح داده شده است، انجام شد. بنابراین، از دو ستون کروماتوگرافی Agilent HP-5ms Ultra Inert (UI) (شماره قطعه 19091S-431UI) استفاده شد و قابلیت Backflush میان‌ستونی توسط واحد Purged Ultimate Union (PUU) آژیلنت که بین دو ستون 15 متری یکسان نصب شده است و ماژول سوئیچینگ پنوماتیک (PSD) روی کروماتوگراف گازی 8890 تأمین می‌گردد.
برای همخوانی با زمان‌های نگهداری در پایگاه داده P&EP 4.0 سیستم MassHunter، روش کسب داده بر اساس زمان ماندگاری قفل می‌شد. پارامترهای اصلی GC و MS در جدول ۲ ذکر شده‌اند. لطفاً برای پیکربندی دقیق GC/TQ به یادداشت کاربردی آژیلنت نوشته‌شده توسط کلینک مراجعه کنید.
تمام داده‌ها در حالت dMRM (طیف‌سنجی توده‌ای چند واکنشی پایش دینامیکی) به دست آمدند.
نتایج و بحث
توسعه روش‌های چند ترکیبی
بخش مهمی از این مطالعه، توسعه گذارهای dMRM برای تمام سموم دفع آفات موجود در پایگاه‌های داده آژیلنت بود. برای LC/MS/MS از پایگاه داده MRM دینامیک سموم دفع آفات آژیلنت استفاده شد. گذارهای MRM و همچنین ولتاژهای خردکننده، انرژی‌های برخوردی و قطبیت یونیزاسیون با استفاده از نرم‌افزار Agilent MassHunter Optimizer به‌وسیله تزریق جریانی بهینه شدند. تقریباً 1600 گذار MRM از 764 سم دفع آفات در روش نهایی dMRM ذخیره شد. عرض پیک‌های کروماتوگرافیک معمولی بین 8 تا 12 ثانیه بود. زمان چرخه انتخاب‌شده 490 میلی‌ثانیه تضمین می‌کرد که نقاط داده کافی در سراسر پیک‌های کروماتوگرافی برای تعیین کمیت دقیق و تأیید نتایج جمع‌آوری شود.
برای GC/MS/MS، بیشتر ترکیبات قبلاً در پایگاه داده MassHunter P&EP فهرست شده بودند. [4] ترکیباتی که گذارهای MRM آنها در این پایگاه داده فهرست نشده بود، با استفاده از MassHunter Optimizer برای GC/TQ توسعه داده شدند. MassHunter Optimizer با شروع یک روش GC که جداسازی خوب ترکیبات کروماتوگرافیک را فراهم می‌کند، ابتدا یون‌های پیشرو و یون‌های محصول را شناسایی می‌کند، سپس انرژی‌های برخورد را برای هر ترکیب امیدوارکننده پیشرو-محصول برای شناسایی بهترین پارامترهای MRM بهینه می‌کند. حدود 2100 گذار MRM از 341 سم دفع آفات در روش نهایی dMRM ذخیره شد. زمان چرخه انتخاب‌شده 300 میلی‌ثانیه تضمین می‌کرد که نقاط داده کافی در سراسر پیک‌های کروماتوگرافی برای تعیین کمیت دقیق و تأیید نتایج جمع‌آوری شود.
روش GC به زمان قفل‌‌شده برای مطابقت با زمان‌های نگهداری در پایگاه داده P&EP آژیلنت تنظیم شد که برای ایجاد بدون مشکل روش MS استفاده شد. استفاده از P&EP باعث سهولت و سرعت راه‌اندازی یک روش هدفمند dMRM شد. قفل شدن بر اساس زمان نگهداری به ستون یا دستگاه جدید اجازه می‌دهد تا زمان‌های نگهداری کاملاً با پایگاه داده MRM یا یک روش موجود مطابقت داشته باشد، به این ترتیب روش‌ها را می‌توان به راحتی از یک دستگاه به دستگاه دیگر و در سراسر جهان منتقل کرد. این امر باعث ساده‌سازی نگهداری روش و راه‌اندازی سیستم می‌شود.
برای برآورده کردن الزامات نظارتی برای شناسایی و تأیید به ترتیب توسط LC/MS/MS و GC/MS/MS، دو یا سه گذار MRM ویژه هدف برای هر سم در هر روش انتخاب شد. [1] داده‌ها در حالت dMRM (پایش چند واکنشی دینامیکی جرمی) به دست آمدند که این امکان را برای انجام سنجش‌های چند تجزیه‌ای بزرگ و تعیین کمیت دقیق پیک‌های باریک با توزیع زمان توقف خودکار و کارآمدترین فراهم می‌کند. علاوه بر این، dMRM به تحلیلگر این امکان را می‌دهد که به راحتی ترکیبات اضافی را اضافه یا حذف کند.
ارزیابی اثر ماتریس
اثرات ناشی از ماتریس نمونه اغلب رخ می‌دهد و باعث سرکوب یا افزایش پاسخ سیستم آشکارسازی طیف جرمی می‌شود.[1] اثر ماتریس (ME) با نسبت پاسخ هدف در استانداردهای تطبیق داده شده با ماتریس به استانداردهای حلال مربوطه ارزیابی شد. به طور معمول، معیار پذیرش سختی برای ME وجود ندارد، زیرا ME را می‌توان با منحنی کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس اصلاح کرد. با این حال، ME پارامتر مهمی برای ارزیابی حساسیت و قابلیت اطمینان روش است و سرکوب یا افزایش سیگنال کمتر از 20 درصد معمولاً به عنوان اثر ماتریس ناچیز در نظر گرفته می‌شود.[1]
در این مطالعه، اثر ماتریس با استفاده از یک استاندارد 10 میکروگرم بر لیتر در عصاره گوجه فرنگی (استاندارد پس اسپایک‌شده) بررسی شد و پاسخ آن با استاندارد حلال مربوطه مقایسه گردید. استاندارد 10 میکروگرم بر لیتر انتخاب شد، زیرا این کمترین سطح مجاز باقیمانده (MRL) برای سموم دفع آفات و متابولیت‌های آنهاست.
در غلظت 10 میکروگرم بر لیتر، بیش از 45 درصد از 1021 هدف در گوجه فرنگی اثر ماتریس قابل توجهی نشان دادند. بر اساس نتایج ارزیابی اثر ماتریس، در این مطالعه از استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس برای جبران اثر ماتریس استفاده شد.
تأیید عملکرد ورک فلو
معیارهای عملکرد ورک‌فلو بر اساس لینئاریته، حساسیت روش، بازیابی و دقت تأیید شدند. بچ آزمایش شامل حلال خالی، استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس، ماتریس خالی و نمونه‌های QC پیش اسپایک شده بود. برای نمونه‌های QC پیش اسپایک شده، شش تکرار فنی تهیه شد.
خطی بودن (Linearity): منحنی‌های کالیبراسیون برای همه ترکیبات با استفاده از استانداردهای تطبیق داده شده با ماتریس در محدوده 0.5 تا 100 میکروگرم بر لیتر و با هشت نقطه کالیبراسیون ایجاد شدند. رگرسیون خطی یا درجه دوم با وزن دهی 1/x و مبدأ نامشخص برای ایجاد منحنی کالیبراسیون استفاده شد. محدوده کالیبراسیون بر اساس نیازهای حساسیت LOQ و انتخابگری تعیین شد. نتایج در شکل 3 نشان می دهد که بیش از 98٪ از اهداف معیار لینئاریته منحنی کالیبراسیون R2 ≥ 0.99 را برآورده کرده اند. [1] تنها برخی از ترکیبات به دلیل عدم حساسیت در سطوح پایین کالیبراسیون یا اشباع شدن آشکارگر در سطوح غلظت بالا، محدوده کالیبراسیون اصلاح شده ای را نشان دادند.
حد تشخیص دستگاهی (LOD)
یک روش کاری حساس برای تجزیه و تحلیل باقیمانده سموم دفع آفات برای کاربران مفید است تا بتوانند عملیات روتین را مطابق با دستورالعمل‌های مختلف نظارتی انجام دهند. برای ارزیابی حساسیت روش از حد تشخیص دستگاهی (LOD) استفاده شد. LOD دستگاهی بر اساس استانداردهای کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس برای نسبت سیگنال به نویز (S/N) معادل 10 یا بیشتر تعیین شد. نسبت S/N با استفاده از ارتفاع پیک و الگوریتم پیک به پیک جاسازی شده در نرم افزار MassHunter Quantitative Analysis تعریف شد. ناحیه نویز به صورت دستی انتخاب شد و حداقل طول آن 0.1 دقیقه بود.
همانطور که در شکل 4 نشان داده شده، بیش از 97 درصد از ترکیبات هدف، حد تشخیص دستگاهی کمتر یا مساوی 10 میکروگرم بر لیتر را نشان دادند و حتی در سطح غلظت 1 میکروگرم بر لیتر، بیش از 88 درصد از ترکیبات دارای نسبت S/N معادل 10 یا بیشتر بودند. این نتایج حساسیت بالای هر دو سیستم، طیف‌سنج جرمی سه رباعی 6470 LC/MS و طیف‌سنج جرمی سه رباعی 7010 GC/MS را در برابر یک ماتریس پیچیده مانند عصاره خام QuEChERS گوجه فرنگی نشان می‌دهد.
دقت و بازیابی روش
دقت روش با استفاده از تکرارپذیری بازیابی (RSDr) بر اساس تغییرات مقادیر بازیابی از تکرارهای فنی نمونه های QC پیش اسپایک شده که در سطح 10 میکروگرم بر کیلوگرم اسپایک شده بودند، برآورد شد. RSDr با محاسبه انحراف معیار نسبی درصدی (%RSD) بازیابی با استفاده از این شش آماده سازی فنی تعیین شد. به طور معمول، RSDr قابل قبول 20٪ یا کمتر است.
مقدار RSDr برای 98٪ از تمام اهداف در محدوده 20٪ قرار داشت و نشان دهنده رفتار سازگار با هر آماده سازی فنی بود. این نتایج تکرارپذیری بالای این روش کاری را تأیید می کند. شکل 5 نشان می دهد که اکثر قریب به اتفاق ترکیبات دارای RSD برای نرخ‌های بازیابی کمتر از 20٪ بودند.
بازیابی
بازیابی در این آزمایش برای ارزیابی توانایی یک روش کاری تحلیلی کمی برای بیش از 1000 سم استفاده شد. بازیابی بر اساس نسبت پاسخ آنالیت بین نمونه‌های QC پیش اسپایک‌شده و سطوح کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس مربوطه محاسبه شد. میانگین بازیابی در سطح 10 میکروگرم بر کیلوگرم برای شش تکرار فنی به دست آمد.
طبق دستورالعمل SANTE 11312/2021، میانگین بازیابی در صورتی که سازگار باشد (RSDr ≤ 20%) در محدوده 40 تا 120 درصد قابل قبول است. بر اساس این معیارها، نتایج میانگین بازیابی برای بیش از 97 درصد از اهداف موجود در عصاره خام QuEChERS گوجه فرنگی در سطح 10 میکروگرم بر کیلوگرم، معیارهای پذیرش را برآورده کرد.
اکثر قریب به اتفاق ترکیبات (975) در محدوده بازیابی 70 تا 120 درصد قرار داشتند و تنها 26 ترکیب (3%) به ترتیب کمتر از 70 درصد یا بالاتر از 120 درصد بودند (شکل 6).
ترکیب LC/MS/MS و GC/MS/MS به کاربران این امکان را می‌دهد تا طیف وسیعی از سموم دفع آفات و متابولیت‌های موجود در مواد غذایی را پوشش دهند. به دلیل ساختار مولکولی این دسته عظیم از ترکیبات، تجزیه و تحلیل انواع سموم دفع آفات تنها با تکنیک‌های GC یا LC غیرممکن است. بهره‌گیری از هر دو تکنیک، امکان پوشش گسترده‌ای از این باقیمانده‌ها را فراهم می‌کند که به طور بالقوه می‌توانند سلامت انسان را به خطر بیندازند.
روش کاری ارائه شده از هر دو تکنیک استفاده کرد و در مجموع 764 سم دفع آفات توسط LC/MS/MS و 341 ترکیب توسط GC/MS/MS تجزیه و تحلیل شد. تمام نتایج دقیق را می‌توان در منابع [2] و [3] یافت. علاوه بر این، این آنالیزها شامل 84 باقیمانده سموم دفع آفات بود که می‌توان آنها را با هر دو تکنیک تجزیه و تحلیل کرد. این مزیت زمانی آشکار می‌شود که برای مثال، نتایج مثبت باید تأیید شوند یا حساسیت بالاتری مورد نیاز باشد.
در شکل 7، کروماتوگرام‌های سیلافلئوفن در یک نمونه ماتریس اسپایک شده در سطح 10 میکروگرم بر کیلوگرم نشان داده شده است. کروماتوگرام سمت چپ نشان می‌دهد که حساسیت با استفاده از LC/MS/MS برای به دست آوردن نتایج قابل اعتماد در حد مجاز باقیمانده (MRL) معادل 10 میکروگرم بر کیلوگرم به اندازه کافی خوب نبود. راه‌حل کامل آژیلنت امکان تجزیه و تحلیل این ترکیب با استفاده از GC/MS/MS را فراهم می‌کند و در نتیجه حساسیت بسیار بهتری را به همراه دارد (کروماتوگرام سمت راست).
استفاده از تکنیک دیگر برای تجزیه و تحلیل تأییدی را می‌توان برای بیفنترین نشان داد. این ترکیب را می‌توان با هر دو تکنیک به طور قابل اعتمادی کمیت‌گیری کرد. کروماتوگرام‌های شکل 8 به طور واضح نشان می‌دهند که حساسیت برای تعیین و تأیید نتایج مثبت با هر دو تکنیک LC یا GC به اندازه کافی بالا است.
نتیجه‌گیری
این یادداشت کاربردی، قابلیت اعمال یک روش کاری حساس و قابل تکرار را برای تعیین کمیت سریع و قابل اعتماد بیش از 1000 باقیمانده سموم دفع آفات در عصاره خام QuEChERS گوجه‌فرنگی مطابق با دستورالعمل SANTE 11312/2021 نشان می‌دهد. پروتکل ساده آماده‌سازی نمونه از کیت استخراج Agilent Bond Elut QuEChERS EN برای استخراج آسان بدون نیاز به پاکسازی بیشتر نمونه استفاده می‌کند. یک روش آماده‌سازی نمونه واحد را می‌توان استفاده کرد و سپس برای تجزیه و تحلیل بعدی با LC/MS/MS و GC/MS/MS به دو بخش تقسیم کرد.
یک سیستم کروماتوگرافی مایع Agilent 1290 Infinity II همراه با یک طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 6470 LC برای تعیین کمیت 764 سم دفع آفات و یک کروماتوگراف گازی Agilent 8890 همراه با یک طیف‌سنج جرمی سه رباعی Agilent 7010C برای تعیین کمیت 341 باقیمانده سم با کالیبراسیون تطبیق داده شده با ماتریس استفاده شد. هر دو روش زمان اجرای 20 دقیقه‌ای داشتند و پیکربندی ستون‌ها جداسازی کروماتوگرافی خوب و توزیع یکنواخت زمان نگهداری برای همه اهداف را ارائه می‌داد. برای دستیابی به کارآمدترین استفاده از زمان چرخه دستگاه، تمام داده‌ها در حالت dMRM به دست آمدند.
روش‌های dMRM بر اساس پایگاه‌های داده MRM سموم دفع آفات آژیلنت ایجاد و توسعه داده شدند. عملکرد کلی روش کاری از نظر لینئاریته، حد تشخیص دستگاهی (LOD)، بازیابی و دقت ارزیابی شد و نشان داد که این روش برای تعیین کمیت بیش از 1000 باقیمانده سم در همان عصاره خام QuEChERS مناسب است.
