جداسازی و اندازه‌گیری همزمان هفت داروی بدون نسخه با استفاده از ستون Agilent InfinityLab Poroshell 120
چکیده
یک روش عمومی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با فاز معکوس، باینری (RP‐HPLC) با استفاده از سیستم Agilent 1260 Infinity II LC برای تعیین همزمان هفت ماده موثره دارویی شامل استامینوفن، دکسترومتورفان، دوکسیلامین، فنیل افرین، گایفنسین، کافئین و آسپرین توسعه و تأیید شد. جداسازی در مدت زمان پنج دقیقه روی ستون Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8، 2.1 × 150 میلی‌متر، 2.7 میکرومتر با استفاده از یک روش گرادیان خطی ساده با دو فاز متحرک به دست آمد. فاز متحرک A محلول ۰.۱ درصد اسید تری فلوئورواتیک در آب خالص و فاز متحرک B مخلوطی از استونیتریل و متانول (750:250 حجمی به حجمی) با 0.1 درصد اسید تری فلوئورواتیک بود. سرعت جریان ۰.۳۵ میلی‌لیتر در دقیقه و حجم تزریق ۵ میکرولیتر بود. آشکارسازی در طول موج ۲۸۰ نانومتر با استفاده از آشکارگر آرایه دیود انجام شد. به عنوان بخشی از تأیید روش، اختصاصیت، خطی بودن و پارامترهای دقت بررسی شدند. روش عمومی RP‑HPLC پیشنهادی برای آنالیز روتین محصولات بدون نسخه (OTC) سرماخوردگی و سرفه کاربرد دارد.
مقدمه
داروهای بدون نسخه (OTC)، که به راحتی در داروخانه‌ها و فروشگاه‌های عمومی در دسترس هستند، برای استفاده به مجوز پزشک نیاز ندارند. این داروها در اشکال مختلفی از جمله قرص، کپسول مایع و شربت موجود هستند و به طور کلی برای مصرف خودسرانه ایمن در نظر گرفته می‌شوند. شرکت‌های دارویی متعددی با ترکیب دو یا چند ماده مؤثره دارویی در اشکال دوز واحد مانند قرص، کپسول نرم و شربت مایع برای سهولت مصرف (به عنوان مثال، پاراستامول، که همچنین به عنوان استامینوفن (ACE) شناخته می‌شود و آسپرین (ASP)، که همچنین به عنوان اسید استیل سالیسیلیک شناخته می‌شود) اقدام به ساخت داروهای OTC می‌کنند.بررسی منابع علمی نشان می‌دهد که به دلیل فراگیری و سرعت بالای تحلیل، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) روش ترجیحی بسیاری از محققان برای آنالیز داروهای سرماخوردگی و سرفه است. انواع قرص‌های چند جزئی، کپسول‌های نرم و فرمولاسیون‌های مایع حاوی اجزای فعال مانند استامینوفن (ACE)، دکسترومتورفان (DEX) و کافئین (CAF) در بازار به وفور یافت می‌شوند و به طور رایج برای رفع علائم سرماخوردگی و سرفه استفاده می‌شوند. در نتیجه، بسیاری از محققان تلاش‌های خود را بر توسعه روش‌هایی متمرکز کرده‌اند که بتوانند یک یا چند مورد از این مواد مؤثره را در فرمولاسیون‌های مختلف به طور همزمان شناسایی و کمیت‌دار کنند. با استفاده از امکانات مختلف تجزیه‌ای، از جمله کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روش‌های مختلفی با پروتکل‌های متفاوت گزارش شده است.
هدف اصلی این مطالعه، توسعه یک روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) سریع، ساده و عمومی با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع Agilent 1260 Infinity II برای آنالیز همزمان هفت ترکیب خاص بود. تا آنجا که ما می‌دانیم، تنها یک روش HPLC تک مرحله‌ای برای برآورد همزمان این هفت ماده مؤثره با زمان اجرای 20 دقیقه پیش از این گزارش شده است. با توجه به این موضوع، یک پروتکل HPLC ساده، سریع و مقرون به صرفه برای برآورد همزمان این ترکیبات، توسعه و تأیید شد.
ستون‌های حاوی ذرات متخلخل سطحی Agilent بازدهی بالایی را در فشار پایین‌تر نسبت به ستون‌های مشابه با ذرات کاملاً متخلخل ارائه می‌دهند. این امر عمدتاً به دلیل مسافت انتقال جرم کوتاه‌تر و توزیع اندازه ذرات بسیار باریک‌تر ذرات داخل ستون است.
آخرین روند استفاده از ذرات متخلخل سطحی، کاهش اندازه ذرات برای بهبود بیشتر بازدهی است. بازدهی بالاتر می‌تواند برای سرعت بخشیدن به آنالیزها یا بهبود نتایج از طریق افزایش تفکیک‌پذیری و حساسیت مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، ستون‌های Agilent InfinityLab Poroshell 120 برای این روش انتخاب شدند.
در طول تأیید روش، تأثیر تغییرات سرعت جریان و دمای محفظه ستون بر جداسازی این ترکیبات مورد بررسی قرار گرفت.
سیستم HPLC و نرم افزار
در این مطالعه از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) مدل Agilent 1260 Infinity II به همراه نرم افزار Agilent OpenLab CDS استفاده شد. سیستم در پیکربندی استاندارد مورد استفاده قرار گرفت و جزئیات دستگاه در جدول 1 ذکر شده است. (جدول 1 در متن اصلی نیست)
مواد شیمیایی
استامینوفن، کافئین، آسپرین، دکسترومتورفان، دوکسیل‌آمین، فنیل‌افرین و گایفنسین از شرکت Sigma-Aldrich خریداری شدند. ستون Poroshell 120 EC-C8 با ابعاد 2.1 × 150 میلی‌متر و اندازه ذرات 2.7 میکرومتر (شماره قطعه 693775-906) مورد ارزیابی قرار گرفت. اسید تری‌فلورواتیک (TFA) از شرکت Sigma-Aldrich خریداری شد. متانول و استونیتریل (درجه HPLC) از شرکت Honeywell (Burdick and Jackson) تهیه شدند. سیستم Milli-Q (Millipore) آب با هدایت الکتریکی 18 مگااهم بر سانتی‌متر را تأمین کرد که از فیلتر 0.2 میکرومتر عبور داده شد.
آماده سازی محلول‌های استاندارد اولیه
ابتدا تمام محلول‌های اولیه برای شفافیت بیشتر در متانول تهیه شدند و سپس برای رسیدن به غلظت نهایی ACE (80 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، DEX (300 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، DOX (125 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، PHE (80 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، ASP (80 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، CAF (25 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و GUA (50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) با محلول استاندارد مخلوط آماده شده حاوی 0.1 درصد اسید تری‌فلورواتیک (فاز متحرک A) رقیق شدند.
نتایج و بحث
به طور کلی، داروهای ضد سرماخوردگی و سرفه بدون نسخه (OTC) در ترکیب‌های مختلف و انواع فرمولاسیون‌های گوناگون در بازار موجود هستند. هدف اولیه توسعه این روش، ایجاد یک روش تحلیلی سریع و ساده برای جداسازی ترکیبات با تقارن و تفکیک‌پذیری قله (پیک) خوب بود. برای بهینه‌سازی شرایط کروماتوگرافی، توسعه روش با انتخاب ترکیبات بافر و فاز متحرک آغاز شد.
آزمایش اول
آزمایش اول برای انتخاب یک بافر سازگار با LC/MS همراه با اصلاح کننده های آلی انجام شد. برای فاز متحرک A، از 0.1% اسید تری فلوئورواتیک (TFA) در آب تصفیه شده به عنوان بافر و 100% متانول به عنوان فاز متحرک B استفاده شد. ستون Poroshell 120 EC-C8 (2.1 × 150 میلی‌متر، 2.7 میکرومتر) برای جداسازی ترکیبات انتخاب شد. شکل 2 شرایط کروماتوگرافی را نشان می دهد.
محلول مخلوط استاندارد با استفاده از 5 میکرولیتر به سیستم کروماتوگرافی مایع 1260 Infinity II تزریق شد و پاسخ آشکارساز با نرم افزار OpenLab CDS مانیتور گردید. تمامی پیک ها (فنل افرین (PHE)، استامینوفن (ACE)، کافئین (CAF)، دوکسیل آمین (DOX)، گایفنسین (GUA)، آسپرین (ASP) و دکسترومتورفان (DEX)) در مدت 17 دقیقه زمان اجرا خارج شدند (شکل 2).
برای انتخاب طول موج، استاندارد مخلوط به آشکارگر آرایه دیودی تزریق شد. حداکثر جذب برای PHE (271 نانومتر)، ACE (242 نانومتر)، CAF (203 و 271.0 نانومتر)، DOX (201 و 260.0 نانومتر)، GUA (222 و 272 نانومتر)، ASP (225 و 274 نانومتر) و DEX (277 نانومتر) مشاهده شد.
اکثر اجزا حداکثر جذب را در محدوده 270 تا 280 نانومتر نشان دادند و همه پیک ها در 280 نانومتر پاسخ خوبی را نشان دادند. پارامترهای مناسب بودن سیستم (مانند فاکتور دم و صفحات تئوری) رضایت بخش بودند، اما تفکیک پذیری بین CAF و DOX کافی نبود و زمان اجرای روش کاهش یافت.
آزمایش دوم
آزمایش ۲ با جایگزینی فاز متحرک B با استونیتریل (100٪) در حالی که سایر شرایط کروماتوگرافی بدون تغییر باقی ماند، انجام شد. محلول استاندارد مخلوط به سیستم کروماتوگرافی مایع 1260 Infinity II تزریق شد و کروماتوگرم در نرم افزار OpenLab CDS پردازش گردید. تمام پیک‌های (فنل‌افرین (PHE)، استامینوفن (ACE)، کافئین (CAF)، دوکسیل‌آمین (DOX)، گایفنسین (GUA)، آسپرین (ASP) و دکسترومتورفان (DEX)) در مدت 14 دقیقه زمان اجرا خارج شدند (شکل 3). پارامترهای مناسب بودن سیستم (فاکتور دم، صفحات تئوری و تفکیک‌پذیری) بین همه پیک‌ها رضایت‌بخش بودند، اما زمان اجرای روش نیاز به کاهش داشت.
آزمایش سوم
آزمایش 3 برای کاهش زمان اجرای روش، با تغییر برنامه گرادیان (شکل 4 را ببینید) و سرعت جریان (به 0.35 میلی‌لیتر در دقیقه) انجام شد. سایر شرایط کروماتوگرافی مشابه آزمایش 1 باقی ماند.
محلول مخلوط استاندارد به سیستم 1260 Infinity II تزریق شد و پاسخ آشکارساز با نرم افزار OpenLab CDS مانیتور گردید. تمامی پیک‌های (فنل‌افرین (PHE)، استامینوفن (ACE)، کافئین (CAF)، دوکسیل‌آمین (DOX)، گایفنسین (GUA)، آسپرین (ASP) و دکسترومتورفان (DEX)) در مدت 5.2 دقیقه زمان اجرا خارج شدند (شکل 4).
اگرچه پارامترهای مناسب بودن سیستم مانند فاکتور دم و صفحات تئوری رضایت‌بخش بودند، اما تفکیک‌پذیری بین پیک‌های فنل‌افرین و استامینوفن، و کافئین و دوکسیل‌آمین برای ادغام پیک‌ها کافی نبود.
آزمایش چهارم
برای افزایش تفکیک‌پذیری بین پیک‌های فنل‌افرین و استامینوفن و کافئین و دوکسیل‌آمین، فاز متحرک B با مخلوطی از 0.1 درصد اسید تری‌فلورواتیک در استونیتریل و متانول (حجم به حجم 75:25) تغییر یافت. برنامه گرادیان نیز دوباره تغییر داده شد (شکل 5). سایر شرایط کروماتوگرافی مشابه آزمایش 1 باقی ماند.
محلول مخلوط استاندارد به سیستم کروماتوگرافی مایع 1260 Infinity II تزریق شد و پاسخ آشکارساز با نرم افزار OpenLab CDS مانیتور گردید. تمامی پیک‌های (فنل‌افرین (PHE)، استامینوفن (ACE)، کافئین (CAF)، دوکسیل‌آمین (DOX)، گایفنسین (GUA)، آسپرین (ASP) و دکسترومتورفان (DEX)) در مدت پنج دقیقه زمان اجرا خارج شدند (شکل 5).
پارامترهای مناسب بودن سیستم (فاکتور دم، صفحات تئوری و تفکیک‌پذیری بین پیک‌ها) رضایت‌بخش بودند. در طول موج مشخص شده، هیچ تداخلی از حلال رقیق‌کننده (فاز متحرک A) مشاهده نشد. روش کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس (RP‐HPLC) پیشنهادی، به عنوان سریع‌ترین و برترین روش برای تعیین هفت ماده موثره در یک فرایند واحد به اثبات رسید. شکل 6 همپوشانی کروماتogram های بهینه‌سازی روش را نشان می‌دهد و شرایط نهایی LC در جدول 2 ذکر شده است.
تأیید روش
خطی بودن:
طبق دستورالعمل ICH Q2 (R1)، خطی بودن روش با تهیه شش غلظت مختلف از آنالیت هدف مورد ارزیابی قرار گرفت. غلظت‌ها به شرح زیر بودند: استامینوفن (ACE) 32 تا 112 میکروگرم بر میلی‌لیتر، دکسترومتورفان (DEX) 120 تا 480 میکروگرم بر میلی‌لیتر، دوکسیل‌آمین (DOX) 48 تا 168 میکروگرم بر میلی‌لیتر، فنیل‌افرین (PHE) 32 تا 112 میکروگرم بر میلی‌لیتر، آسپرین (ASP) 32 تا 112 میکروگرم بر میلی‌لیتر، کافئین (CAF) 10 تا 35 میکروگرم بر میلی‌لیتر و گایفنسین (GUA) 20 تا 70 میکروگرم بر میلی‌لیتر. تمامی محلول‌ها در رقیق‌کننده (فاز متحرک A) تهیه شدند.
هر غلظت از مخلوط استاندارد سه بار به سیستم HPLC تزریق شد و مقدار میانگین برای محاسبه منحنی کالیبراسیون در نظر گرفته شد. نمودارهای کالیبراسیون با رسم مساحت پیک در مقابل غلظت داروهای استاندارد ترسیم شد. مقدار ضریب رگرسیون برای همه گونه‌ها R2 = 0.9999 به دست آمد. این نشان‌دهنده‌ی درجه قابل قبولی از خطی بودن است. کروماتوگرم‌های خطی‌بودن در شکل 7 و منحنی‌های کالیبراسیون در شکل 8 نشان داده شده‌اند.
ویژگی
ویژگی روش با تزریق یک محلول خالی (فاز متحرک A) مورد ارزیابی قرار گرفت. هیچ تداخلی با زمان ماندگاری پیک‌های آنالیت مشاهده نشد. روش بهینه شده قادر به جداسازی پیک‌های رقیق‌کننده از زمان‌های ماندگاری آنالیت‌های ACE، DEX، DOX، ASP، PHE، CAF و GUA بود.
دقت
دقت روش با تهیه شش نمونه مجزا از مخلوط همگن محلول اصلی حاوی ACE (80 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، DEX (300 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، DOX (120 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، ASP (80 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، PHE (80 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، CAF (25 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و GUA (50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) انجام شد. دقت روش بر اساس درصد RSD (انحراف معیار نسبی) نتایج شش نمونه‌ی مجزا تعیین شد. مقادیر %RSD در سطح غلظت 100% کمتر از 2.0% یافت شد. کروماتوگرم‌های همپوشانی دقت در شکل 9 نشان داده شده است.
مقاومت
برای ارزیابی استحکام روش بهینه شده، شرایط کروماتوگرافی به طور عمدی تغییر داده شد و محلول مخلوط استاندارد به HPLC تزریق گردید. سرعت جریان فاز متحرک به 0.30 و 0.40 میلی‌لیتر در دقیقه تغییر یافت و دمای ستون به 25 تا 35 درجه سانتیگراد تغییر کرد. در هر تجزیه یک پارامتر انتخاب شده تغییر داده شد، در حالی که سایر شرایط ثابت نگه داشته شدند. هیچ تغییر قابل توجهی در نتایج مناسب بودن سیستم مشاهده نشد. کروماتوگرم همپوشانی استحکام در شکل 10 نشان داده شده است.
نتیجه گیری
این مقاله یک روش گرادیانی است. این روش سریع و کم هزینه برای تجزیه و تحلیل هفت ماده مؤثره داروهای OTC ارائه می دهد.با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) مدل Agilent 1260 Infinity II در دمای 35 درجه سانتیگراد و فشار تقریباً 350 بار (5365 پوند بر اینچ مربع) به کار گرفته شد. زمان اجرای کروماتوگرافی حدود پنج دقیقه بود. سرعت جریان روش 0.35 میلی‌لیتر در دقیقه بود. مصرف فاز متحرک برای اجرای توالی تزریق بسیار کم بود (1.75 میلی‌لیتر به ازای هر تزریق).
