تجزیه اسیدآمینه خوراک ماهی باAgilent1260
بهینه سازی روش تجزیه اسید آمینه خوراک ماهی برای شناسایی 4 ترکیب اضافیاین مطالعه روشی بهبود...
بهینه سازی روش تجزیه اسید آمینه خوراک ماهی برای شناسایی 4 ترکیب اضافی
این مطالعه روشی بهبودیافته برای تعیین کمی اسیدهای آمینه در دو خوراک ماهی مختلف پس از هیدرولیز اسیدی ارائه می دهد. روش کروماتوگرافی اسید آمینه موجود آژیلنت با افزودن چهار ترکیب دیگر (تورین، تئانین، گلوکزامین و سیستئین) بهینه شد. تجزیه و تحلیل با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع متصل به آشکارساز DAD و آشکارساز فلورسانس انجام شد. مشتق سازی خودکار پیش ستون با استفاده از برنامه تزریقگر خودکار Agilent 1260 Infinity II Multisampler انجام شد. حساسیت بالاتر DAD برای سیستئین و سیستین، مزایای استفاده از تشخیص UV همراه با FLD را تایید کرد.
مقدمه
تغذیه خوراک ماهی در پرورش ماهی از اهمیت بالایی برخوردار است. درک پروفایل اسید آمینه موجود در خوراک ماهی برای تضمین رشد و سلامت ماهی ضروری است. ترکیب اسید آمینه خوراک ماهی عاملی مهم است که به عملکرد رشد ماهی کمک می کند. تورین، سیستئین، تئانین و گلوکزامین اسیدهای آمینه اضافی هستند که به عنوان تقویت کننده رشد و ایمنی در ماهی گزارش شده اند. از این رو، یک روش کروماتوگرافی که قادر به جداسازی هر 24 اسید آمینه باشد برای غربالگری اسیدهای آمینه در خوراک ماهی ضروری است. مشتق سازی پیش از ستون و پارامترهای روش از راهنمای "نحوه انجام" تجزیه و تحلیل اسید آمینه آجیلنت اقتباس شده است.
نکات کلیدی:
- اهمیت: اسیدهای آمینه بلوک های سازنده پروتئین هستند و برای رشد و توسعه ماهی حیاتی هستند.
- فواید: دانستن ترکیب اسید آمینه خاص به فرموله کردن خوراک ماهی بهینه برای عملکرد بهتر کمک می کند.
- اسیدهای آمینه کلیدی: تورین، سیستئین، تئانین و گلوکزامین رشد و ایمنی ماهی را تقویت می کنند.
- روش: کروماتوگرافی برای جداسازی و شناسایی 24 اسید آمینه در خوراک ماهی استفاده می شود.
- بهینه سازی: روش بر اساس راهنمای تجزیه و تحلیل اسید آمینه آژیلنت است، اما برای شامل شدن چهار اسید آمینه اضافی بهینه شده است.
- نتیجه: این روش بهینه شده ابزاری ارزشمند برای تولیدکنندگان خوراک ماهی و محققان برای موارد زیر ارائه می دهد:
- تجزیه و تحلیل پروفایل اسید آمینه خوراک های مختلف ماهی
- فرموله کردن خوراک با تعادل اسید آمینه بهینه برای نیازهای خاص ماهی
- افزایش رشد، سلامت و ایمنی ماهی از طریق تغذیه هدفمند
با درک ترکیب اسید آمینه خوراک ماهی، می توانیم تغذیه بهینه را برای این حیوانات آبزی تضمین کنیم و به سلامت آنها و پایداری روش های پرورش ماهی کمک کنیم.
تجزیه و تحلیل اسید آمینه با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با اجزای زیر انجام شد:
Part Number Component
G7112B Agilent 1260 Infinity II Binary Pump
G7167A Agilent 1260 Infinity II Multisampler
G7116A Agilent 1260 Infinity II Multicolumn Thermostat
G7117C Agilent 1260 Infinity II Diode Array Detector HS (with fixed slit)
G7121B Agilent 1260 Infinity II Fluorescence Detector Spectra
G1321-60005 Flow cell, 8 µL, 20 bar
- تمامی حلال ها از درجه LC بودند. استونیتریل از JT Baker (فیلپسبورگ، نیوجرسی، آمریکا) و متانول از مرک (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. آب فوق خالص تازه از سیستم Milli-Q Integral (Millipak، مرک-میلیپور، بیلرکا، ماساچوست، آمریکا) مجهز به یک کارتریج نقطه استفاده غشاء 0.22 میکرومتر به دست آمد.
- فسفودی هیدروژن سدیم دو پایه، تترابورات دی سدیم ده هیدرات، اسید هیدروکلریک غلیظ (37٪) و اسید فسفریک (85٪) از Sigma Aldrich (سنت لوئیس، MO، آمریکا) خریداری شد.
- کیت استانداردها و معرف های Agilent AdvanceBio AAA (شماره قطعه 5190-9426) شامل:
- شماره قطعه | جزئیات
- -------- | --------
- 5061-3339 | بافر بورات: 0.4 M در آب، pH 10.2، 100 میلی لیتر
- 5061-3337 | معرف FMOC، 2.5 میلی گرم در میلی لیتر در استونیتریل، 10 × 1 میلی لیتر آمپول
- 5061-3335 | معرف OPA، 10 میلی گرم در میلی لیتر در بافر بورات 0.4 M و اسید 3-مرکاپتوپروپونیک، 6 × 1 میلی لیتر آمپول
- 5061-3330 | استاندارد اسید آمینه (مخلوط 14 استاندارد)، 1 نانو مول در میکرولیتر، 10 × 1 میلی لیتر
- 5061-3331 | استاندارد اسید آمینه، 250 پیکومول در میکرولیتر، 10 × 1 میلی لیتر
- 5061-3332 | استاندارد اسید آمینه، 100 پیکومول در میکرولیتر، 10 × 1 میلی لیتر
- 5061-3333 | استاندارد اسید آمینه، 25 پیکومول در میکرولیتر، 10 × 1 میلی لیتر
- 5061-3334 | استاندارد اسید آمینه، 10 پیکومول در میکرولیتر، 10 × 1 میلی لیتر
- 5062-2478 | کیت مکمل اسیدهای آمینه (حاوی L-آسپارژین، L-گلوکزامین، L-تریپتوفان، L-4-هیدروکسی پرولین، L-نروالین (IS) و سارکوزین (IS))، هر کدام 1 گرم
- چهار اسید آمینه دیگر که به روش تجزیه و تحلیل اسید آمینه اضافه شدند از Sigma-Aldrich خریداری شد.
- شماره قطعه | اسیدهای آمینه
- -------- | --------
- SMB00395 | L-تئانین
- PHR1109 | تورین
- PHR1199 | گلوکزامین هیدروکلراید
- 168149 | L-سیستئین
آماده سازی حلالها و معرف ها:
- فاز متحرک A حاوی 10 میلی مولار Na2 HPO4 و 10 میلی مولار Na2 B4 O7 ، با pH 8.2 بود.
- فاز متحرک B حاوی استونیتریل، متانول و آب (45/45/10، v/v/v) بود.
- 0.1 N HCl با رقیق سازی مناسب HCl غلیظ با استفاده از آب تهیه شد.
- رقیق کننده: 10 میلی لیتر از فاز متحرک A + 200 میکرولیتر اسید فسفریک (85٪)
- مواد شیمیایی
تمام حلال های مورد استفاده از نوع LC بودند. استونیتریل خریداری شد
از JT Baker (فیلیپسبورگ، نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا) و متانول بود
از Merck (دارمشتات، آلمان) خریداری شده است. اولترا خالص تازه
آب از یک سیستم انتگرال Milli-Q (Millipak،
Merck-Millipore، Billerica، MA، USA) مجهز به 0.22 میکرومتر
کارتریج نقطه استفاده غشایی سدیم فسفات دی بازیک،
دی سدیم تترابورات دکاهیدرات، هیدروکلریک غلیظ
اسید (37٪) و اسید فسفریک (85٪) از آن خریداری شد
سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا).
کیت استانداردها و معرف های Agilent AdvanceBio AAA
(شماره قطعه 5190-9426) شامل:
جزء شماره قطعه
بافر بورات 5061-3339: 0.4 مولار در آب، pH 10.2، 100 میلی لیتر
5061-3337 معرف FMOC، 2.5 میلی گرم در میلی لیتر در استونیتریل، آمپول 1 × 10 میلی لیتر
5061-3335 معرف OPA، 10 میلی گرم در میلی لیتر در بافر 0.4 مولار بورات و
3-مرکاپتوپریونیک اسید، آمپول 6 × 1 میلی لیتر
5061-3330 استاندارد اسید آمنیو (ترکیبی از 14 استاندارد)، 1 نانومول در میکرولیتر، 10 × 1 میلی لیتر
5061-3331 استاندارد اسید آمنیو، 250 pmol/μL، 10 × 1 میلی لیتر
5061-3332 استاندارد اسید آمنیو، 100 pmol/μL، 10 × 1 میلی لیتر
5061-3333 استاندارد اسید آمنیو، 25 pmol/μL، 10 × 1 میلی لیتر
5061-3334 استاندارد اسید آمنیو، 10 pmol/μL، 10 × 1 میلی لیتر
5062-2478
کیت مکمل اسیدهای آمینه (حاوی ال-آسپاراژین، ال-گلوتامین،
ال-تریپتوفان، L-4-هیدروکسی پرولین، ال-نوروالین (IS) و سارکوزین
(IS))، هر کدام 1 گرم
چهار آمینو اسید دیگر که به اسید آمینه اضافه شدند
روش تحلیل از سیگما آلدریچ خریداری شد.
قسمت شماره اسیدهای آمینه
SMB00395 L-Theanine
تورین PHR1109
PHR1199 گلوکوزامین هیدروکلراید
168149 ال سیستئین
تهیه حلال ها و معرف ها
- فاز متحرک A حاوی 10 میلی مولار Na2 است
HPO4
، و 10 میلی متر
Na2
B4
O7
PH 8.2.
- فاز B متحرک حاوی استونیتریل، متانول و
آب (45/45/10، v/v/v).
– 0.1 نیوتن هیدروکلراید با رقت مناسب تهیه شد
HCl غلیظ با استفاده از آب
– رقیق کننده: 10 میلی لیتر فاز متحرک A + 200 میکرولیتر فسفر
اسید (85%)
– توجه: پس از باز کردن OPA یا FMOC
آمپول، معرف ها به کهربا تقسیم می شوند
ویال (شماره قطعه 5182-0716) با درج
(شماره قطعه 5181-1270) و درپوش پیچ
(شماره قطعه 5190-7024). برای ذخیره شده بودند
بیش از یک هفته نیست
– توجه: بافر بورات و رقیق کننده تزریقی منتقل شد
به ویال های بدون درج. همه معرف ها باید ذخیره شوند
در دمای 4 درجه سانتی گراد و معرف ها در نمونه گیری خودکار باید باشند
روزانه رد و بدل می شود.
تهیه محلول های استاندارد اسید آمینه
1. محلول ذخیره شده اسید آمینه (EAA): 1.8 نانومول در میکرولیتر
هر کدام از آسپاراژین، گلوتامین، و تریپتوفان، تیانین،
تورین، گلوکزامین و 18 نانومول بر میکرولیتر سیستئین در
0.1 مولار هیدروکلراید.
2. محلول انبار رقیق شده EAA:
- 0.9 نانومول در میکرولیتر،
- 0.45 نانومول در میکرولیتر،
- 0.18 نانومول در میکرولیتر،
– 90 pmol/μL،
- 45 pmol/μL،
- 18 pmol/µL و
– 9 pmol/µL با 0.1 مولار HCl.
غلظت سیستئین در EAA رقیق شده:
– 9 نانومول در میکرولیتر،
– 4.5 نانومول بر میکرولیتر،
– 1.8 نانومول بر میکرولیتر،
– 900 pmol/μL،
– 450 pmol/μL،
– 180 pmol/μL و
- 90 pmol/µL با 0.1 مولار HCl.
3. استاندارد داخلی (IS) محلول ذخیره: 1.0 نانومول در میکرولیتر هر یک از
نوروالین و سارکوزین در 0.1 مولار هیدروکلراید.
4. محلول های EAA + IS: EAA و IS را به نسبت 1:1 مخلوط کنید تا به دست آید
غلظت اسید آمینه 4.5 تا 900 pmol/μL (سیستئین
در 45 تا 9000 pmol/μL) و غلظت IS بود
500 pmol/μL.
5. غلظت نهایی اهداف اسید آمینه در
راه حل های کالیبراسیون:
- 0.45 (L1)، 0.90 (L2)، 2.25 (L3)، 4.5 (L4)، 9.0 (L5)،
22.5 (L6)، 45 (L7) و 90 (L8) pmol/μL اسیدهای آمینه
(برای همه به جز سیستئین) با IS 50 pmol/μL
- برای سیستئین، غلظت سطح کالیبراسیون بود
4.5 (L1)، 9.0 (L2)، 22.5 (L3)، 45 (L4)، 90 (L5)، 225 (L6)،
450 (L7) و 900 (L8) pmol/µL با IS 50 pmol/µL
منبع نمونه خوراک ماهی
خوراک ماهی 1 و خوراک ماهی 2 سخاوتمندانه توسط
یک مشتری.
آماده سازی نمونه
برای استخراج اسیدهای آمینه در خوراک ماهی،
نمونه ها با استفاده از 6 N HCl به دنبال یک روش هیدرولیز شدند
توصیف شده توسط دای و همکاران 6
همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است
10 گرم از خوراک ماهی با استفاده از a. وزن و همگن شد
تکان دهنده مکانیکی یک نمونه 500 میلی گرمی همگن شده
خوراک ماهی در یک لوله شیشه ای 15 میلی لیتری برای استخراج وزن شد.
آب و HCl غلیظ (37%) به نمونه اضافه شد
تا 10 میلی لیتر HCl 6 نیوتن به دست آید. لوله ها درپوش بودند و
برای هضم به مدت 24 ساعت در دمای 110 درجه سانتیگراد نگهداری می شود.
لوله ها پس از 2 ساعت برای سهولت به آرامی تکان داده شدند
هضم کارآمد
پس از هضم، لوله ها تا دمای اتاق خنک شدند
و با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. Captiva چابک
از فیلترهای سرنگ درجه یک (شماره قطعه 5190-5108) استفاده شد
برای فیلتر کردن 1 میلی لیتر مایع رویی. سپس، 10 میکرولیتر از فیلتر شده
مایع رویی با 990 میکرولیتر آب رقیق شد تا 100 برابر شود
رقیق شدن سپس 950 میکرولیتر از نمونه رقیق شده هموژنه شد
به 50 میکرولیتر از محلول استوک IS اضافه شد و بر روی آن تجزیه و تحلیل شد
سیستم LC 1260 Infinity II.
قابلیت کاربرد روش برای تجزیه و تحلیل خوراک ماهی
کروماتوگرام FLD اسیدهای آمینه درون زا موجود است
در خوراک ماهی 1 به صورت شکل 5A نشان داده شده است. سیستئین و سیستین
فقط در DAD قابل تشخیص بودند (شکل 5B و C). استفاده كردن
DAD و FLD به صورت سری منجر به شناسایی بدون ابهام می شود
از اسیدهای آمینه مشخصات آمینو اسید از خوراک ماهی
نمونه های 1 و 2 مشابه و نتایج مقایسه هستند
در شکل 6 نشان داده شده است.
هیدرولیز اسیدی می تواند منجر به تبدیل آسپاراژین شود،
گلوتامین، و سیستئین به اسید آسپارتیک، اسید گلوتامیک، و
سیستین به ترتیب و تریپتوفان تجزیه می شود.6
مانند
در نتیجه، در هر دو ماتریس ماهی، این اسیدهای آمینه یکی هستند
وجود ندارد یا در غلظت های پایین وجود دارد.
برای تجزیه و تحلیل بازیابی اسید آمینه، ماتریس خالی مشخص شد
در غلظت سطح 6 غلظت درون زا
از اهداف از ماتریس postspik کم شد
و با سطح کالیبراسیون 6 مقایسه شده و به صورت بیان شده است
درصد (جدول 4). بازیابی اسیدهای آمینه فردی
بین 70 تا 130 درصد برای همه ترکیبات در هر دو ماهی بود
ماتریس های خوراک به جز اسید گلوتامیک در خوراک ماهی 1. اینها
نتایج نشان دهنده مناسب بودن روش برای
تجزیه و تحلیل مشخصات اسید آمینه برای تغذیه ماهی.
نتیجه
این یادداشت کاربردی اسید آمینه موثر را نشان می دهد
پروفایل نمونه های خوراک ماهی با استفاده از Agilent 1260 Infinity
سیستم II LC با آرایه دیود Agilent 1260 Infinity II
آشکارساز (DAD) و Agilent 1260 Infinity II فلورسانس
آشکارساز (FLD). روش به حساسیت خوبی برای
تشخیص 24 اسید آمینه با استفاده از کمترین کالیبراسیون
مخلوط استاندارد منطقه عالی و دقت RT تایید شده است
تکرارپذیری روش وضوح اوج
همراه با تشخیص DAD/FLD ویژگی و
انتخاب پذیری برای شناسایی مطمئن اسیدهای آمینه را
مشتق سازی خودکار پیش ستونی، دفترچه راهنما را حذف می کند
مراحل انتقال مایعات و کاهش منابع خطای انسانی،
با مزیت اضافی صرفه جویی در زمان. کارایی از
روش جدید توسعه یافته برای کمی سازی دقیق آمینو
اسیدهای حاصل از نمونه خوراک ماهی پیچیده نشان داده شده است. را
پاکسازی نمونه با استفاده از فیلترهای سرنگ درجه یک Agilent Captiva
تداخل ماتریس را به حداقل می رساند و هدف خوبی را ارائه می دهد
بهبود. این روش برای پروفایل آمینو اسیدها مناسب است
از نمونه های مختلف خوراک ماهی