HPLC چیست؟ نحوه کار دستگاه کروماتوگراف مایع
در دنیای پیشرفته علم و فناوری، تکنیک‌های تحلیلی به طرز چشمگیری برای شناسایی، جداسازی و تجز...
کنترل کیفیت الکترولیت های باتری لیتیوم یون با استفاده از LC/MS
چکیدهبازده و طول عمر باتری های لیتیوم یون تا حد زیادی به کیفیت الکترولیت وابسته است. تقریب...
تجزیه و تحلیل ویتامین B12 در شیرخشک نوزادان
استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) Agilent 1260 Infinity II Prime با...
استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) Agilent 1260 Infinity II Prime با آشکارساز آرایه دیودی (DAD)
چکیده
ویتامین B12 آزاد در سطوح پایین ppb (پارت در میلیارد) موجود در شیر خشک نوزادان را می توان با اطمینان در مدت زمان 3.5 دقیقه با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) Agilent 1260 Infinity II Prime همراه با آشکارساز آرایه دیودی (DAD) آنالیز کرد.
در این روش، از سلول جریان کارتریج Agilent InfinityLab Max-Light با مسیر جریان 60 میلی متری و یک ستون پاک سازی ایمونوافینتی نیز استفاده شده است.
مقدمه
ویتامین B12، همچنین به عنوان کوبالامین شناخته می شود، یک ویتامین محلول در آب است که به طور غالب به شکل 5'-دی اکسی آدنوزیل کوبالامین و متیل کوبالامین در بافت های زنده وجود دارد. هیدروکسوکوبالامین، که به دلیل شکستن پیوند کربن-کبالت در 5'-دی اکسی آدنوزیل کوبالامین و متیل کوبالامین با قرار گرفتن در معرض نور تشکیل می شود، به مقدار کمی وجود دارد. ویتامین B12 یک ماده مغذی ضروری برای رشد انسان، توسعه سلولی، متابولیسم اسیدهای آمینه و سنتز DNA است. با این حال، ویتامین B12 تنها توسط میکروارگانیسم های پروکاریوتی تولید می شود. بنابراین، تنها منابع طبیعی ویتامین B12 برای انسان رژیم غذایی حیوانی است. برخی از فرآورده های غذایی، مانند غلات و فرمول های تغذیه ای بزرگسالان، با سیانوکوبالامین، باثبات ترین شکل دارویی ویتامین B12، غنی می شوند تا نیاز روزانه را تامین کنند. ساختارهای اشکال مختلف ویتامین B12 در شکل 1 نشان داده شده است.
به طور سنتی، ویتامین B12 در فرآورده های غذایی به دلیل حساسیت بالای آن از طریق سنجش های میکروبیولوژیکی تعیین می شود، اما گزارش شده است که این روش دقت و گزینش پذیری پایینی دارد. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) با آشکارساز ماوراء بنفش (UV) یکی از روش های جایگزین برای تجزیه و تحلیل ویتامین B12 است. به طور کلی، اشکال پروتئین-بسته شده ویتامین B12 در فرآورده های غذایی ابتدا باید از طریق هیدرولیز اسیدی یا آنزیمی آزاد شوند، سپس قبل از تجزیه و تحلیل، در حضور گرما و یون های سیانید به اشکال سیانو تبدیل شوند. غلظت ویتامین B12 در فرآورده های غذایی به طور معمول پایین است، بنابراین یک ستون پاک سازی ایمونوافینتی برای بهبود بیشتر گزینش پذیری و حساسیت در فرآیند آماده سازی نمونه گنجانده شده است. این روش پیشرفته در روش رسمی AOAC 2014.02 منتشر شده است.
این مطالعه روشی برای آنالیز سریع ویتامین B12 در شیرخشک نوزاد با تکیه بر روش رسمی AOAC 2014.02 ارائه می دهد.
این روش بر ارزیابی محتوای ویتامین B12 غنی شده/آزاد بدون استفاده از ترکیبات سیانید (مانند سیانید سدیم یا پتاسیم) تمرکز دارد. سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای 1260 Infinity II Prime به دلیل داشتن حداکثر فشار 800 بار، امکان استفاده از ستون هایی با ذرات ریز را برای دستیابی به شکل پیک (peak shape) و حساسیت عالی فراهم می کند.
قانون بیر-لامبرت بیان می کند که طول مسیر سلول جریان آشکارساز با جذب نور توسط گونه های آنالیت متناسب است. بنابراین، برای افزایش بیشتر حساسیت تشخیص، به جای سلول جریان استاندارد با طول مسیر 10 میلی متری، از یک کارتریج سلول جریان InfinityLab Max-Light با طول مسیر 60 میلی متر در آشکارساز آرایه دیودی Agilent 1290 Infinity II استفاده شد. این ترکیب یک راه حل کارآمد برای تعیین ویتامین B12 ارائه می دهد.
آزمایش
تجهیزات
سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا 1260 Infinity II Prime از ماژول های زیر تشکیل شده است:
نرم افزار
برای جمع آوری و تفسیر داده ها از نرم افزار Agilent OpenLab CDS نسخه 2.7 استفاده شد.
مواد شیمیایی و حلال ها
مواد شیمیایی و حلال های استفاده شده در تجزیه و تحلیل به شرح زیر است:
- استونیتریل (درجه HPLC، خریداری شده از Aik Moh Paints & Chemicals Pte. Ltd.)
- اسید فرمیک (درجه LC/MS، خریداری شده از Aik Moh Paints & Chemicals Pte. Ltd.)
- آب بدون یون (آب Milli-Q)
- سیانوکوبالامین (درجه آنالیز)
- استات سدیم (درجه ACS، خریداری شده از Sigma‑Aldrich Pte. Ltd.)
- اسید استیک (درجه ACS، خریداری شده از Sigma-Aldrich Pte. Ltd.)
نمونه ها
در این پژوهش از دو نمونه استفاده شد:
- ماده مرجع استاندارد شیرخشک نوزاد (NIST1869)
- شیرخشک نوزاد خریداری شده از یک سوپرمارکت محلی
ملزومات آماده سازی نمونه
برای پاکسازی ماتریس نمونه از ستون ایمونواینتی EASI-EXTRACT VITAMIN B12 (LGE) از شرکت R-Biopharm استفاده شد.
روش های معمول آماده سازی نمونه
رویه های آماده سازی نمونه برای شیرخشک نوزاد در شکل 2 خلاصه شده است.
نتایج و بحث
اعتبارسنجی روش
حد کمی سازی (LOQ): حد کمی سازی یک آنالیت اغلب به عنوان غلظتی تعریف می شود که در آن نسبت سیگنال به نویز (S/N) آنالیت 10 در نظر گرفته می شود. در این مطالعه، LOQ که از پایین ترین سطح خطی سازی استاندارد ویتامین B12 با غلظت 3 نانوگرم بر میلی لیتر تعیین شد، برابر با 1.2 نانوگرم بر میلی لیتر بود.
خطی بودن:
برای رسم منحنی کالیبراسیون،系列 (seri - سری) استانداردهای ویتامین B12 با غلظت های مختلف (یعنی 1، 5، 10، 25، 50، 100 و 250 نانوگرم بر میلی لیتر) تزریق شد. این منحنی خطی بودن عالی را نشان داد، با ضریب همبستگی (R²) نزدیک به 1. شکل 3 منحنی کالیبراسیون استانداردهای ویتامین B12 را نشان می دهد.
تکرارپذیری
برای ارزیابی تکرارپذیری استاندارد بر اساس انحراف معیار نسبی (RSD) زمان ماند و مساحت پیک، مجموعاً شش تزریق متوالی از استانداردهای ویتامین B12 با غلظت 3 نانوگرم بر میلی لیتر انجام شد (شکل 4). تکرارپذیری عالی بود، با RSD زمان ماند کمتر از 0.1٪ و RSD مساحت پیک 1.16٪. اطلاعات دقیق در جدول 1 ارائه شده است.
بازیابی
برای بررسی بازیافت این روش تحلیلی، مقدار ویتامین B12 موجود در ماده مرجع استاندارد NIST1869 مورد آنالیز قرار گرفت. با مقایسه ویتامین B12 بازیابی شده از نمونه NIST1869 با مقدار مرجع ارائه شده در گواهی آنالیز، بازیافت 88.8 درصدی با داده های بازیافت ارائه شده توسط تامین کننده ستون ایمونواینتی (IAC) که در محدوده 70 تا 110 درصد بود مطابقت دارد.
نتایج دقیق آنالیز در جدول 2 آمده است و کروماتوگرام در شکل 5 نشان داده شده است.
تجزیه و تحلیل نمونه
شیرخشکی از یک سوپرمارکت محلی خریداری شد و محتوای ویتامین B12 آن با موفقیت تعیین گردید. کروماتوگرام و مقدار ویتامین B12 در شکل 6 نشان داده شده است.
ویتامین B12 به طور طبیعی در مقادیر کم در شیرخشک وجود دارد و این موضوع، علاوه بر پیچیدگی ماتریس شیرخشک، بر دشواری تشخیص آن می افزاید. استفاده از ستون ایمونواینتی برای حذف تداخلات احتمالی ماتریس و در نتیجه بهبود حساسیت تشخیص ویتامین B12 در شیرخشک ضروری است. مرحله تغلیظ نمونه قبل از تزریق نیز به افزایش حساسیت تشخیص کمک می کند.
نتیجه گیری
یک روش آنالیز سریع برای بررسی محتوای ویتامین B12 در شیرخشک نوزاد با استفاده از سیستم کروماتوگرافی مایع با کارایی بالای Agilent 1260 Infinity II Prime توسعه و اعتبارسنجی شده است. این روش به همراه ستون Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-Aq و سلول جریان کارتریج Agilent InfinityLab Max-Light با طول مسیر 60 میلی متر، به حساسیت بالا و بازیافت عالی در تعیین ویتامین B12 در شیرخشک نوزاد دست یافته است.